192646. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új N-alkil-peptid-aldehidek előállítására
1 192 646 /. táblázat 2 Tripeptid-aldehid-szulfátok antitrombin aktivitásának változása vizes oldatban (pH = 6,0) 40 °C-on Peptid-aldehid3 Kezdeti aktivitás Aktivitás (%) Y—Pro-Arg—H.H2S04 I D Aso (0. nap) 1. nap 3. nap 5. nap Y = H-D -MePhe 0,25 (100 %) 100 100 100 H-D-EtPhe 0,21 (100%) 100 100 85 H—D—iBuPhe 0,31 (100%) 100 85 80 H-D-Phe 0,35 (100%) 100 50 40 (referens) aA rövidítések megfelelnek a szakirodalomnak [pl. Biochem. J., 126, 773 (1972)], valamint H— D— MePhe, H—D—EtPhe és H—D—iBuPhe jelentése N-metil-, N-etil-, illetve N-izobutil—D-fenilalanin-csoport. 20 A H—D—Phe—Pro—Arg—H.H2 S04 eredeti aktivitásának több, mint felét elveszti a megfigyelés ideje alatt. Ugyanakkor az N-metil-származék megőrzi eredeti hatékonyságát, az N-etil- és N-izobutil-vegyület 25 aktivitása pedig csak 15—20%-kal csökken. Az adott kísérleti körülmények között számolni kell az L-arginin-aldehid-terminális részleges racemizációjával is. Az N-etil- és N-izobutil-származéknál tapasztalt kis mértékű aktivitás-csökkenés erre vezethető vissza. 30 Megvizsgáltuk az N-alkil-tripeptid-aldehideknek a plazmin-fibrin reakcióra gyakorolt hatását is az N-metil-D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szulfát példáján az alábbi rendszerben: 0,2 ml 0,5%-os marhafibrinogén 0,9%-os konyha- 35 só oldatban, 0,1 ml trisz(hidroximetil)-amino-metán-klórhidrát-sósav puffer (pH = 7,2), amely a pepiidet tartalmazza, 0,1 ml pufferben oldott 0,1 egység plazmin 40 (KABI, Stockholm, Svédország) és 0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bethesda, Maryland, USA) 10 egység/ml. A rendszerben keletkező fibringél oldódásának ideje peptid nélkül 10.60 S. (kontroll). 45 Referens-vegyületként a H— D—Phe— Pro-Arg—H- szulfátot, valamint a fentebb említett Boc—D—Phe- Pro —Arg—H.] H2 S04 acil-tripeptid-aldehid-hemiszulfátot használtuk. Az eredményeket a II. táblázatban foglaltuk össze. 50 Az adatokból kitűnik, hogy az N-alkil-tripeptidaldehid az amino-terminálisű analóghoz hasonlóan viselkedik. Kis mennyiség esetén a keletkező alvadék a kontrollidő alatt oldódik fel, nagyobb mennyiség esetén a keletkező gél laza szerkezetű, illetve nem is kép- 55 ződik alvadék. Ugyanakkor az acil-tripeptid-aldehidhemiszulfát koncentrációtól függően növeli a fibrinalvadék plazminos hidrolízisének (oldásának) idejét. A fenti vizsgálatokból kitűnik, hogy az új, aminoterminálison alkilezett tripeptid-aldehidek az ismert 60 H-D-Phe-Pro-Arg-H-szulfátnál lényegesen állandóbb vegyületek, s ugyanakkor ez utóbbihoz hasonlóan szelektív alvadásgátlók, a trombin-fibrinogén reakció hatékony gátlása mellett a plazmin-fibrin reakció lefutását nem akadályozzák. 65 bI80 = az a umol-ban megadott peptid-mennyiség 1 1 reakcióelegyben, amelynél a rendszer alvadási ideje a kontroll ötszörösére nyúlik. II. táblázat Tripeptid-aldehidek hatása a plazmin-fibrin reakcióra Peptid-; ddehid3 Peptidtartalom M mól A fibrin-alvadék oldás-ideje (s)b H —D —MePhe —Pro-0,18 10.60 *-Arg—H.H2 S04 0,36 0,72 nincs alvadék H-D-The-Pro-0,18 10.60 —Arg—H.H2S04 0,36 _C (referens) 0,72 nincs alvadék Boc—D -Phe—Pro-0,18 10.60-Arg—H.|]H2S04 0,36 20.60 (referens) 0,72 40.60 aA rövi lítések jelentését lásd az I. táblázatnál, ill. Boc jelentése t-butil-oxi-karbonil-csoport. bA fíbrin-alvadék oldás-ideje peptid nélkül 10.60 s. cAz olcás-idő nem határozható meg, az alvadék laza szerkezetű. Az 1 általános képletű új N-alkil-tripeptid-aldehidek jelentős mértékű véralvadásgátló hatást mutatnak in vivo körülmények között is. Vizsgálatainkban 2—3 kg súljú új-zélandi hím nyulaknak intravénásán, illetve orálisan adtuk a peptideket oldószerként fiziológiás konyhasó-oldatot alkalmazva. Intravénás adásmódnál 0,5—2,0 mg/kg/h dózisban 6 ml/h sebességgel 3 órás infúziót alkalmaztunk. Orálisan 20—30 mg/kg/prptidet adtunk 2 ml térfogatban. A vegyületek beadása után 30 perces időközökben vérmintákat vettünk a nyulak fülvénájából és Thrombelastographban meghatároztuk a teljes vér alvadási idejét [H.Hartel: Zsclir. f. clin. Med. 153, 423 (1955)]. Egyidejűleg meghatároztuk a plazma trombin-idejét is [R.T.S. Jim: J. Láb. Clin. Med. 50, 45 (1957)]. A terápiás 3
