192642. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak és purinbázisok kivonására zselatinból
1 2 192 642 A találmány szerint alkalmazott ciklodextringyöngypolimer regenerálása céljából a nukleinsavakat és purinbázisokat eluálással távolítjuk el; vagy úgy, hogy a gyöngypolimert mintegy ötszörös mennyiségű eluens oldatban néhányszor elkeverjük, majd leszűrjük, vagy úgy, hogy ugyanezt a mennyiségű eluenst átfolyatjuk az oszlopon. Az eluensből 1 óra alatt az oszloptöltet-térfogat 20—40%-ának megfelelő menynyiséget áramoltatunk keresztül. Eluensként 7,5 — 10,5 pH-értékű pufferoldatot használunk, amely 0,1—0,2 mol/liter NaCl-t is tartalmazhat. A polimerrészecskéken adszorbeálódott zselatint forró vizes mosással és/vagy enzimes kezeléssel (proteáz) távolítjuk el. Az utóbbi művelet után vizes mosást alkalmazunk. A találmány szerinti eljárás előnyei a következők: 1. A ciklodextrin-gyöngypolimerrel mind a nukleinsavak, mind a purinbázisok egy műveletben eltávolíthatók. 2. A ciklodextrin-gyöngypolimer DNS és purinbázis megkötő képessége nagyobb a dextránalapú gyantákénál. 3. A ciklodextrin-gyöngypolimer alkalmazása gazdaságosabb a dextránalapuakénál. A találmány szerinti eljárást a következő kiviteli példákkal szemléltetjük. 1. példa Vízköpennyel ellátott, ultratermosztáttal 45 °C hőmérsékleten tartott, 300 ml térfogatú edénybe bemérünk 15 g szárazanyagot tartalmazó, nátrium-ace- 5 tát/ecetsav pufferben (pH = 3,4) előduzzasztott ß-ciklodex trin-gyöngypolimert (részecskeméret d 90—300 p, ciklodextrintartalom 56%, poli (vinilalkohol)-tartalom 0,4%, majd hozzáöntünk 100 ml, 0,025 g/1 koncentrációjú DNS-oldatot és a reakció- 10 elegyet 1 órán át keverjük. A bemérést úgy is elvégezzük, hogy 15 g szárazanyagot tartalmazó, KH2P04-pufferben (pH = 7,5) előduzzasztottt Molselect G-50 (d = 100-320 p) illetve Sephadex G—50 (d = 50—150 ju) gyöngypoli- 15 mert alkalmazunk. A diszperzióból mindhárom esetben szűréssel eltávolítjuk a polîmerrészecskéket, s azokat eluálás céljából 5x100 ml KH2P04 (NaOH-pufferrel/pH= 10,5/, amely 0,2 mol/liter NaCl-ot tartalmaz, 30—30 20 percen át keverjük, majd szűrjük. Az eluátumok gátlóanyagtartalmát spektrofotometriásán mérjük. A vizsgálatot ezután a három gyöngypolimerrel az előzőekhez hasonló módon újból elvégezzük, le azzal a különbséggel, hogy a DNS-oldat 25 helyett 100 ml 0,015 g/liter koncentrációjú adeninoldatot alkalmazunk. __Az eredményeket a 2. táblázat mutatja be. 2. táblázat Gátlóanyagtartalom, mg Gátló-Ciklodextrin Molselect Sephadex anyag B K K ■ K B K • K K B B B B DNS 2,5 2,3 0,92 2,5 1,57 0,63 2,5 1,8 0,72 AD 1,5 1,35 0,91 1,5 1,07 0,71 1,5 1,14 0,76 Megjegyzés: B = bevitt anyag, K = kivont anyag Az adatokból kitűnik, hogy a ciklodextrin polimer mind a DNS-t, mind az adenint jobb hatásfokkal köti meg, mint a dextránalapú anyagok. 2. példa Az 1. példában leírt feltételek mellett lOOmlnátrium-acetát (ecetsav pufferben/pH = 3,4) feloldunk 2,5 mg DNS-t és 5 g gátlóanyagot nem tartalmazó, inert zselatint. Az oldathoz hozzáadunk 15 g szárazanyagot tartalmazó, nátrium-acetát/ecetsav pufferben 55 /pH = 3,4) előduzzasztott 0-ciklodextrin-gyöngypolimert (d = 90-300 p ciklodextrintartalom 59%, poli (vinil-alkohol)-tartalom 0,3% s a diszperziót 3 órán át keverjük. A bemérést úgy is elvégezzük, hogy Molselect 60 G— 50 gyöngypolimert (d = 100—320 p) és KH2P04 puffert (pH = 7,5) alkalmazunk. A diszperzióból mindkét esetben szűréssel eltávolítjuk a polimerrészecskéket, s azokat eluálás céljából 5x100 ml KH2P04 (NaOH pufferrel (pH = 10,5), 65 amely 0,2 mol/liter NaCl-ot tartalmaz, 30—30 percen 45 át keverjük, majd szűrjük. Az eluátumok gátlóanyagtartalmát spektrofotometriásán mérjük. A vizsgálatot ezután a két gyöngypolimerrel az előbbiek szerint újból elvégezzük, de azzal a különbséggel, hogy DNS helyett 1,5 mg adenint mérünk be. 50 Az eredményeket a 3. táblázat mutatja be. 3. táblázat Gát lóanyag Gátlóanyagtartalom, mg Ciklodextrin Molselect B K K B“ B K JLB DNS 2,50 2,30 0,92 2,50 1,80 0,72 AD 1,50 1,36 0,91 1,50 1,00 0,66 Megjegyzés: B = bevitt anyag, K = kivont anyag 3
