192642. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak és purinbázisok kivonására zselatinból
2 192 642 A találmány tárgya eljárás nukleinsavak és purinbázisok kivonására zselatinból, ciklodextrin-gyöngypolimerek alkalmazásával. A zselatinban részben eredendően, részben gyártástechnológiája következményeként nagyszámú szer- 5 vetlen és szerves mikrökomponens fordul elő. Az utóbbiak közé tartoznak a nukleinsavak és purinbázisok, amelyek a zselatintartalmú ezüsthalogenid fotográfiai emulziókban mind a kristályok növekedését, mind a fényérzékenység kifejlődését visszatart- 10 ják (T. H. James: The Theory of the Photographic Process, MacMillan, New York, 1977). E gátlóanyagok jelenléte sok esetben nem kívánatos, ezért a zselatingyártók régi törekvése, hogy a zselatinból ezeket eltávolítsák. 15 A nukleinsavak és származékaik kivonására általában ioncserélő gyantákat alkalmaznak. Elterjedten használják a polisztirol-divinilbenzol kationcserélő gyantákat (például Amberlite típusok). Ezeknek az a hátránya, hogy csak az adenint és a guanint távolít- 20 ják el, a nukleinsavak a zselatinban visszamaradnak (T. Ohno—H. Irie: J. Soc. Phot. Sei. Techn. Japan, 39, (1976/146). Újabban különböző felépítésű dextránszármazékokat is kipróbáltak (például Sephadex típusok). Ezek segítségével a nukleinsavaknak min- 25 tégy 75%-a vonható ki a zselatinból (N. Masuda—H. Kimura: J. Phot. Sei. 30, (1982/124). Az összes gátlóanyag eltávolítására az a lehetőség kínálkozik, hogy a nukleinsavakat nukleázzal alkotóelemeire bontjuk, majd a purinbázisökat kationcserélővei kivonjuk; e 30 módszer azonban költséges. A nukleinsavakat sósavas kezeléssel is hidrolizálhatjuk, ekkor azonban a zselatin is lebomlik, így ennek az eljárásnak az alkalmazása a zselatingyártásban nem lehetséges. A találmány célja olyan eljárás megvalósítása, 35 amellyel mind a nukleinsavak, mind a purinbázisok maradéktalanul és gazdaságosan kivonhatok a zselatin károsodása nélkül. A találmány szerinti eljárásban erre a célra ciklodextrin-gyöngypolimert alkalmazunk. 40 A ciklodextrinek 6, 7 vagy 8 glükopiranóz egységéből felépülő, ciklikus, nem redukáló oligoszacharidok, amelyeket keményítő enzimatikus lebontásával állítanak elő. Gyakorlati felhasználásuk főként zárványkomplexképző képességükön alapul (Szejtli J.: Cyc- 45 lodextrins and Their Inclusion Complexes, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1982). Korábbi vizsgálatokban (Hoffmann, J. L. — Bock, R. M.: Biochemistry, 9, (1970) 3542; Formoso, C.: Biopolymers, 13, (1974/909) differenciál IJV-spekt- 50 roszkópiával megállapították, hogy a-ciklodextrinnel nem reagál többek között az adenozin-, citozin-, guanin-, uridin-monofoszfát, és j3-ciklodextrinneI is csak az adenozin- és az inozin-monofoszfát lép kölcsönhatásba. Dinukleetidokkal a kölcsönhatás gyen- 55 gébb, a polinukleotidok pedig semmiféle kölcsönhatást sem mutattak a ciklodextrinekkel. Ezért meglepő az a tapasztalatunk, hogy a polimerizált ciklodextrin híg vizes oldatokból olymértékben képes megkötni a nukleinsavakat és a purinbázisökat, hogy azok szelek- 60 tív eltávolítására alkalmas. A találmány alapja az a felismerés, hogy a ciklodextrin-gyöngypolimer mind zárványkomplexképzőként, mind adszorbensként képes működni, így a kismolekulatömegű purinbázisok és a nukleinsav-makro- 65 molekulák kivonására egyaránt alkalmas. 2 A ciklodextrin-gyöngypolimerek ciklodextrinnek alkalmas bifunkciós keresztkötő ágenssel (például epiklór-hidrinnel vagy etilénglikol-di (epoxi-propil)éterrel) történő térhálósításával, poli (vinil-acetát) jelenlétében készülnek (177 419 lajstromszámú magyar szabadalom, 1978); ciklodextrin tartalmuk 30—70 tömeg% közötti, előnyösen 50—60 tömeg% közötti, poli (vinil-alkohol) tartalmuk 0,3—0,5 tömeg% közötti, részecskeméretük 20-600 ß között, előnyösen 90—300 (i között változik. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a zselatin-oldathoz 20-600 ju részecskeméretű, 30-70 tömeg% ciklodextrintartalmú és 0,3—0,5 tömeg% poli (vinil-alkohol)-tartalmú ciklodextrin-gyöngypolimert adunk a zselatin tömegére számítva 1:1 és 10:1 közötti tömegarányban, majd a ciklodextrin-gyöngypolimert kiszűrjük vagy a zselatin oldatot ciklodextrin-gyöngypolimer oszlopon vezetjük át, amikoris a zselatin mennyisége az oszloptöltet száraz tömegének 5—50%-a, majd a ciklodextrin-gyöngypolimerből a nukleinsavakat és purinbázisökat eluáljuk. A találmány szerinti eljárásban a zselatin kezelésének befejeztével az oldatból szűréssel különítjük el a gyöngypolimert. A gátlóanyagoktól mentesített zselatinoldat további feldolgozása a szokásos módon történik. A találmány szerint úgy is eljárhatunk, hogy a gyöngypolimert nem a kezelendő zselatin oldatához adagoljuk, hanem oszloptöltetként használjuk. Ilyenkor az 5 — 10 tömeg%-os zselatinoldatot 40—60 °C hőmérsékletű oszlopon folyatjuk át, miközben az oszlopon kezelt száraz zselatin mennyisége az oszloptöltet száraz tömegének 5—50%-a, előnyösen 10—30%-a. A kezeléssel mind a nukleinsavakat, mind a purinbázisokat kivonjuk a zselatinból. Ezt a folyamatot nefelometriás vizsgálattal követhetjük. Ez azon alapul, hogy a kisebb méretű kristályok kevésbé szórják a fényt, mint a nagyobb méretűek, így az utóbbiak vizes, zselatinos szuszpenziója zavarosabb (aX = 546 nmmél mért optikai denzitása nagyobb). A gátlóanyagot tartalmazó zselatinnal készített szuszpenzióban a kristályok alig növekszenek, így meghatározott idejű hőkezelés (Ostwald-érlelés) után kis denzitást kapunk, a gátlóanyagok kivonása után azonban a kristályok megnőnek, így azonos idő elteltével a szuszpenzió nagyobb denzitású lesz. Az 1. táblázatban látható, hogy a viszonylag nagy gátlóanyagtartalmú (700 ppm DNS, 60 ppm adenin) aktív zselatin erősen visszatartja a kristályok növekedését, kezelése után azonban azok majdnem olyan gyorsan nőnek, mint a gátlóanyagot nem tartalmazó inert zselatin esetén. /. Táblázat Hőkezelés ideje, 60 t-on, perc DX546 Aktív zselatin Inert zselatin kezelés előtt kezelés után 5 0,13 0,40 0,51 10 0,20 0,68 0,80 20 0,27 0,97 1,11 40 0,33 1,18 1,30 80 0,34 1,19 1,32
