192585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított, detoxikált endoxint és egy mikroorganizmus piridin-pldható kivonatát tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 192:585 2 emberi tumorokba. A TDE mennyisége egyszeri injekcióban 5 és 1000 mikrogramm között van, célszerűen 25 és 500 mikrogramm között. A PK mennyisége ugyanitt 50 és 5000 mikrogramm között van, előnyösen 200 és 3000 mikrogramm között. A legelőnyösebb dózis-szint TDE-ből 100 mikrogramm és PK-ból 1000 mikrogramm. Mindezek az itt említett dózis-szintek átlagos, 70 kg-os felnőtt páciensre vonatkoznak. Az injekciókat minden héten egyszer adjuk be, összesen kb. 15 injekcióig. Amint korábban említettük, a melegvérű állatok és az ember kezeléséhez alkalmas kompozíciókat fiziológiás sóoldatos vagy olaj-cseppecskés emulzió formájában alkalmazhatjuk. Az alkalmazott olaj mennyiésge 0,5 és 3 térfogat % között van a kompozíció teljes térfogatára vonatkoztatva. Előnyös 0,75 és 1,5 térfogat százalék között alkalmazni az olajat. Az ilyen, itt alkalmazható olajokra példák: könnyű ásványolaj, szkvalén, 7-n-hexil-oktadekán, Conoco-Superoil és Drakeol 6-VR ásványolaj (a Pennreco Company, Butler, Pennsylvania, Amerikai Egyesült Államok, gyártmányai). A keveréket tartalmazó homogenizált olajat azután valamely detergenssel kombináljuk, amelyet előnyösen az összekeverés előtt só-oldatban oldottunk. A detergens mennyisége általában 0,02 és 0,20 térfogat % között van, előnyösen 0,10 és 0,20 térfogat % között a kompozíció teljes térfogatára vonatkoztatva. Bármilyen közismert detergens-anyag alkalmazható, beleértve pl. a Tween—80-at, és az Arlacelt (az Atlas Chemical Company gyártmánya). A detergens hozzáadásával keletkezett keveréket azután szuszpenzió-formájúvá homogenizáljuk, amelyben nagy százalékban vannak jelen olyan olaj-cseppecskék, amelyek az aktív komponensekkel vannak befedve, amint ez mikroszkópos megfigyeléssel meghatározható. Az itt következő példák azt a célt szolgálják, hogy részletesebben mutassák be az eljárást, de nem az a céljuk, hogy korlátozzák,vagy bármilyen formában túlszűkítsék a találmány oltalmi körét, amelyet a leírás végén található igénypontokban igényelünk. 1. PÉLDA — Piridin-oldható kivonat készítése Propionibacterium acnes II. típus-ból (VPI 0204 törzs) Propionibacterium acnes II. típusú törzset (VPI 0204 törzs) növesztünk 37 °C hőmérsékleten NIH tioglikolát tápközegben 48 és 72 óra közti időtartamig, majd a sejteket kinyerjük, teljes sejtek pasztáját kapva. A pasztát azután 500 ml desztillált vízzel mossuk. 90 gramm (nedves súly) mosott pasztát keverünk össze 200 ml hígítatlan piridinnel és a keveréket 1700 g-nél egy órán át 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A piridin-oldható kivonatot, mint felülűszót elkülönítjük. Az ott maradt üledéket további piridin-mennyiséggel extraháljuk az előbbiekben leírtaknak megfelelő körülmények között. A szűrést követően (Whatman 1. papíron) a piridines kivonatokat egyesítjük és az oldószert 50 ÖC hőmérsékleten Buclri Rotavaporban (Brinkmann Instruments, Westbury, New York) bepárlással eltávolítjuk. A száraz piridines kivonatot desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk, majd liofilezziik. Az így készített tisztított piridines kivonat kb. 5 tömeg % fehérjét, kb. 35 tömeg % cukrot és kb. 55 tömeg % zsírsavat tartalmaz. A kivonatot elektronmikroszkóp alatt tanulmányozzuk, és úgy találjuk, hogy mentes a teljes sejt. vagy sejtfal-törmelék szennyeződésektől. A piridin-oldható kivonat kitermelése 9 % (8,1 g). 2. PÉLDA - Piridin-oldható kivonat készítése M. bovis BCG törzsből-M. bovis törzset növesztünk Sauton-tápközegen 37 °C hőmérsékleten 3-4 héten át, majd a sejteket kinyerjük mosott, teljes sejt pasztát kapva. 50 gramm (nedves súly) mosott pasztát az 1. példában leírtakkal azonos módon' kezelünk, így 7 % kitermeléssel (3,5 g) piridin-oldható kivonatot nyerünk. A kivonat 15 tömeg % fehérjét, 10 tömeg % cukrot és 52 tömeg % zsírsavat tartalmaz. 3. PÉLDA — Vizes kivonat készítése 500 mg piridines kivonatot kezelünk ultrahanggal 100 ml desztillált vízben 15-30 percen át. Az így nyert ■ szuszpenziót 12000 fordulat/perccel centrifugáljuk RC2B centrifugában 4 °C hőmérsékleten 40 percen át. A felülúszót dekantáljuk és megőrizzük. Az üledéket még kétszer extraháljuk a fentiek szerint. A felülúszókat liofilező palackban egyesítjük, rétegben lefagyasztjuk és liofilezzük. Kitermelés: 230 mg (46 %). 4. PÉLDA — J'Jyers, detoxikált endotoxin készítése. A Chen éf munkatársai eljárásával [/. Infect, Dis. 128, 543, (1973)] összhangban készült metanol-kloroformos csapadék 650 mg-os mintáját 150 ml 0,1 n sósav-oldatban szuszpendáljuk egy kondenzátorral összeillesztett, háromnyakú, kerekfenekű lombikban, és ultrahangos készülékbe (szonikátorba) merítjük. Az ultrahangos kezelés után az üvegkészüléket 120 °C hőmérsékletet fenntartó olajfürdőbe merítjük, amely lehetővé teszi, hogy a lombik belső hőmérséklete elérje vagy meghaladja az oldat forráspontját. Az oldat tiílhevítését minimálisra lehet csökkenteni olyan módon, hogy egy nitrogéngáz forráshoz kapcsolt kapilláris csövet illesztünk a lombikhoz az egyik nyakon keresztül. Folytonos nitrogén-áramlást tartunk fenn végig a hidrolizálási eljárás folyamán. A hidrolízist 30 percen át folytatjuk, majd az oldatot jégfürdőben lehűtjük, ultrahanggal kezeljük a szilárd anyag szétoszlatása érdekében, majd az anyagot Corexcsövekbé szétosztjuk. A lombikot desztillált vízzel kimossuk, hogy minden, a lombik oldalára tapadó szilárd anyagot elrávolítsunk, és a mosófolyadékot a Corexcsövekben levő szuszpenziókhoz töltjük. A centrifugálást 12000 fordulat/perccel hajtjuk végre 80 percen át. A felülúszót dekantáljuk és elöntjük. A szilárd maradékot desztillált vízben újra szuszpendáljuk, és addig kezeljük ultrahanggal, amíg a szuszpenzió jól elosztott lesz, majd újra centrifugáljuk. A centrifugálási folyamatot még egyszer megismételjük. Az üledéket desztillált vízben felvesszük, rétegben lefagyasztjuk és liofilezzük, 382 mg nyers A lipidet nyerve. 150 mg-ot ebből az anyagból hideg (0 °C) acetonnal kezelünk, hogy a zsírsavakat eltávolítsuk, ultrahanggal kezeljük, majd Whatman 1. gravitációs szűrő berendezésen átszűrjük 5 °C hőmérsékleten. 100 mg nyers, detoxikált endotoxin marad a szárítás végén. 5. FÉLD A - Nyers detoxikált endotoxin készítése. 120 mg MKCs-t (metanol-kloroformos csapadék) szuszpendálunk 12 ml abszolút metanolban, ultrahanggal kezeljük, hogy a szilárd anyagok eloszoljanak és 6 csavaros kupakkal ellátott (1 x 10 cm) üvegcsébe osztjuk szét. Minden üvegcsébe 2 ml 0,2 n HCI-t adunk és a keletkező szuszpenziót forró vízben inkubáljuk 45 percen át. A hidrolízis után a csöveket jégfürdőben lehűtjük és kb. 10 percen át 2500 fordulat/perccel centrifugáljuk. A felülúszót dekantáljuk és az üledékhez 5 ml kloroform-metanol 2 : 1 keveréket adunk, feloldódást érve el ilyen módon. 2 ml vizet adunk csövenként és az oldatot összekeverjük. A kétfázisú oldatot újra centrifugáljuk 2500 fordulat/perccel 10 percen át. A felső, vizes fázist eldobjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
