192585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított, detoxikált endoxint és egy mikroorganizmus piridin-pldható kivonatát tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 192 585 2 és 1 ml kloroform-metanol 4 : 1 keveréket adunk minden csőhöz, amely művelet tiszta oldatot eredményez. Az oldatokat egyesítjük, és az oldószert forgó bepárlóban lepároljuk. A maradékot nagyvákuumban szárítjuk és liofilezzük, 45 mg nyers A lipidet nyerve. Ebből az anyagból 20 mg-ot hideg (0 °C) acetonnal kezelünk, ultrahanggal kezelünk, és az oldatot Whatman 1. gravitációs szűrőberendezéssel szűrjük 5 °C hőmérsékleten, 13 mg nyers, detoxikált endotoxin marad szárítás után. 6. PÉLDA — Tisztított, detoxikált endotoxin előállí- 10 tása. 110 g LH-20-100-at (Pharmacia, 25-100 mikron részecskeméret) keverünk össze 600 ml kloroform-metanol 2 : 1 keverékkel, majd az egészet 30 percig állni hagyjuk. Az így nyert zagyot 25 x 1000 mm-es üveg 15 kromatográfiás oszlopba (BRL Laboratories) helyezzük, amelyen nyomáshoz illeszkedő szerelvény található. Amikor az oszlop töltése befejeződött, az oszlopot Teflon nyomásálló csővezeték segítségével 1SCO 132 Model szivattyúval kötjük össze. 400 ml kJorofoím-metánol 4:1 20 arányú keveréket szivattyúzunk át az oszlopon 3 ml/perc sebességgel. 100 mg nyers, detoxikált endotoxint, amelyet a 4. példával összhangban állítottunk elő, viszünk fel az oszlopra 2,5 ml kloroform-metanol keverékben, mintavevő hurok segítségével. Az áramlást 1 ml/percre csők- 25 kentjük és miután!. 50 ml eluátumot összegyűjtöttünk, a kimenő folyadékáramot frakciógyűjtővel kapcsoljuk össze. 4 ml-cs frakciókat szedünk és a tisztított, detoxikált endotoxin frakciókat a frakciók vékonyréteg-kromatográfiás analízisével határozzuk meg (E. Merck,0,25 mm 30 vastag, futtató: kloroform-metanol-víz-ammónium-hidroxid 50 :25 :4:2). A tisztított, detoxikált endotoxin frakciókat egyesítjük és az oldószert bepárlással eltávolítjuk, így 30 mg tisztított, detoxikált endotoxin marad fehér porként. 35 7. PÉLDA — Tisztított, detoxikált endotoxin előállí- ' tása. 33 g DEAE-cellulózt (Whatman DE-32) szuszpendálunk 150 ml jégecetben és csendesen rázzuk 10 percen át, zagy-szerű port nyerve. A keveréket egy éjszakára félre- 40 tesszük. A zagyot ezután 25 x 400 mm-es oszlopba öntjük, a csap nyitogatásával hagyjuk ülepedni, és a felesleges savat ezután lecsapoljuk. Az oszlopot 2000 ml metanollal, majd 200 ml kloroform-metanol 4 :1 keverékkel mossuk. 100 mg nyers, detoxikált endotoxint, amelyet a 4. példával összhangban állítottunk elő, viszünk rá az oszlopra 3 inl kloroform-metanol 4 :1 keverékben vagy kloroform-metanol-víz 80 :20 :1 keverékben. Az oszlopot 350 kló- ^ rofonn-metanol 4 :1 keverékkel, majd 300 ml metanol-víz 99 : 1 keverékkeleluáljuk. Lineárisgrádienst létrehozó készüléket használva az oszlopot 2000 ml lineáris gradienssel eluáljuk, 100 % metanollal kezdve,és0,2 mól/liter metanolos ecetsav oldattal fejezve be. Az oszlopot 6 ml/perc gg sebességgel eluáljuk és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk. Minden második frakciót analizálunk teljes foszfor-tartalomra Bartlett, G. R. eljárása szerint \Biol. Chem. 234, 466-471 (1959)]. A frakciókat összegyűjtjük és forgó bepárlóban bepároljuk közel száraz állapotig, majd 10 ml klorofonn-metanol 2 :1 keverékben és 40 ml 0,001 mólos ecetsav-oldatban felvesszük választótölcsérben. Az alsó réteget elkülönítjük, Whatman 2. szűrőpapíron átszűrjük és szárazra pároljuk, 19,2 mg tisztított, detoxikált endotoxint nyerve. 8. PÉLDA 23 db 8-10 hetes nőstény C3HeBFeJ egeret injekciózunk intraperitoneálisan 105 petefészek teratokarcinoma sejttel. 24 óra múlva 5 egeret injekciózunk egyszer 5 0,2-0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 50 mikrogramm TDE-t tartalmaz, és 6 egeret injekciózunk egyszer 0,2—0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 300 mikrogramm PK-t és 50 mikrograxnm TDE-t tartalmaz. Végi! 12 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml só-oldattal, ez a kontrol-csoport. 21 nap után az 5 db TDE-vel injekciózott egérből 4 a tumor teljes visszafejlődését mutatja, és a 6 db TDE-vel és PK-val injekciózott egérből 6 db mutatja ugyanezt az eredményt. Másrészt viszont a kontrol-csoport 12 egeréből 10 elpusztul a 21. napig, és a maradék kettő is a rákos sejtek jelenlétének bizonyítékait mutatja. 9. PÉLDA 45 db 8—10 hetes nőstény C3HEJ egeret injekciózunk 105 petefészek teratokarcinoma sejttel. 24 óra múlva 15 egeret injekciózunk egyszer 0,2 -0,5 ml izotóniás konyhasó-oldattal, amely 1400 mikrogramm PK-t tartalmaz, és 15 egeret injekciózunk egyszer 0,2-^,5 ml izotöniás só-oldattal, amely 300 mikrogramm PK-t és 50 mikrogramm TDE-t tartalmaz. Végül 15 egeret injekciózunk egyszer 0,2-0,5 ml izotóniás só-oldattal, ez a kontrol-csoport. 30 nap után 5 db egér a PK-val injekciózott 15 egérből a tumor visszafejlődését mutatja, és még él. Másrészt 14 db egér a kontrol-csoport 15 egeréből elpusztul, a megmaradt 1 egér viszont a tumor vi rszafejlődését mutatja. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás tumor-gátló hatású gyógyászati kompozíció előállítására, azzal jellemezve, hogy- valamely mikroorganizmusból pirídínnel kivonatot készítünk,- valamely bakteriális endotoxinból extraktumot készítünk, — előnyösen metanol-kloroform-eleggyel —,az extraktumot savval kezeljük, majd a zsírsavakat egy, a zsírsavakat oldó, de az endotoxint nem oldó oldószerrel - előnyösen acetonnal — kivonjuk, és a maradékot kromatográfiásan tisztítjuk, így tisztított, kimutatható mennyiségű 2-keto-3-dezoxi-oktanoátot nem tartalmazó, 375—475 runól/mg foszfort és 1700-2000 nmól/ mg zsírsavat tartalmazó, detoxikált endotoxint kapunk,- a piridin-oldható kivonatot'és a tisztított* detoxikált endotoxin hatásos mennyiségét 1 :1 és 100 :1 közötti arányban összekeverjük, és gyógyászatilag alkalmas hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógjríszati kompozícióvá alakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztított piridin-oldható kivonatként M. bovis BCG-ből, M. phlei-ből, M. smegmatisból, M. kansasii-ból, 60 Nocardia rubra-ból, Nocardia asteroidesből, Propionibacterium acnes II. típusból vagy Corynebacterium parvumból nyert kivonatot alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tisztított piridin-oldható kivonatként olyan 65 kivonatot alkalmazunk, amely 3—20 tömeg % fehérjét 5
