192585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított, detoxikált endoxint és egy mikroorganizmus piridin-pldható kivonatát tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 192 585 2 melanómák, pikkelyes sejt karcinómák,petefészek-tumorok, méh-tumorok, húgyhólyag-, fej- és nyak-tumorok. A finomított, detoxikált endotoxin (FDE). Az FDE előállításához szükséges kiindulási anyagként használt típusú endotoxin-extraktumot nyerhetünk bármelyik Enterobacterioceae családba tartozó mikroorganizmusból, szülő-törzsekből és mutánsokból egyaránt. A példa kedvéért a következő nemzetségeket adjuk meg illusztrációként az olyan mikroorganizmus-típusokra, amelyeket jól alkalmazhatunk: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Paterurella, Neisseria, Proteus, Klebsiella és Serratia. Leginkább a következő fajokat használjuk: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni és S. abortus equi. A kiindulási anyagként alkalmazott endotoxikus extraktuniot a számos ismert módszer valamelyikével állíthatjuk elő (lásd pl. 1. Webster, M. E., Sagin, J. F., Landy, M., és Johnson, A. G.:/. Immunoi:, 1955 , 744, 55 2. Westphal, O., Luderitz, O., és Bister, Z. Naturforsch., 76,148 (1952) 3. Westphal, O.: Pyrogens. Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (kiadó:George F. Springer), Madison, New Jersey, Madison Printing Co., 1957,115 4. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O.: Eur. / Biochem., 9, 245 (1969) 5. Chen, C. H., Johnson, A. G., Kasai, N., Key, B. A., Levin, J., Nowotny, A.:/. Infect. Dis. 128, 543, (1973) 6. Ribi, E., Haskins, W. T., Landy, M,, Milner, K. C. The Journal of Experimental Medicine 114, 647 (1961) 7. Leive, L.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 290 (1965) 8. Ribi, E., Milner, K. C. ésPerrine,T.:J.Immunology 82, 75 (1959) Az előnyös módszert, amellyel endotoxikus kivonatot lehet nyerni, Chen és munkatársai hozták nyilvánosságra, nevezetesen a metanol-kloroformos kicsapást. A metanol-kloroformos csapadékot (MKCs) ezután egy szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk, majd liofllezzük, hogy hidrolizált nyers A lipidet állítsunk elő csökkentett toxicitással és pirogén-hatással, ha a kiindulási endotoxin anyaghoz hasonlítjuk. Ezt az anyagot azután egy olyan oldószerrel kezeljük, amely képes fajlagosan feloldani a zsírsavakat és tisztátalanságokat a nélkül, hogy feloldaná a nyers A lipidet. A detoxikált, finomított A lipid foszfát-tartalma mintegy fele annak, amelyet a toxikus endotoxinoknál figyeltek meg, azt sugallva, hogy a foszfát-tartalom kapcsolatban van az endotoxinok toxikus hatásával. Az MKCs-vel való reakcióhoz használt előnyös szerves savak a sósav, kénsav és foszforsav, és az előnyös szerves savak a toluolszulfonsav vagy a triklór-ecetsav. A reakciót megfelelően 90 °C és 130 °C között célszerű végezni annyi ideig, amely elegendő a teljes hidrolízishez. A nyers, detoxikált endotoxin készítését véghez lehet vinni oly módon, hogy a kiindulási anyagot a savval reagáltatjuk egy szerves oldószer jelenlétében, ilyen pl. a kloroform, metanol, etanol és ezek kombinációi. Az így nyert nyers A lipidet aceIonban felszuszpendáljuk, az aceton előnyös oldószer a zsírsavak és egyéb tisztátalanságok feloldásához. Az oldószert ezután eltávolítjuk, így nyers detoxikált endotoxint nyerünk. A nyert detoxikált endotoxint ezután valamely oldószerben feloldjuk és az oldatot megfelelő kromatográfiás oszlopon engedjük át, hogy elkülönítsük a TDE frakciókat, amelyeket azután az oldószer eltávolítása után egyesítünk. A nyers, detoxikált endotoxint Sephadex oszlopon engedjük át olyan oldószerben, mint pl. kloroform, metanol, aceton, piridin, éter vagy ecetsav, vagy ezek kombinációi. Az oszlop nyomása változó lehet, de általában az atmoszférikus nyomás és 6,8 • 105 Pa között van, és az átfolyási sebesség 0,1—10 ml/perc között. A nyers, detoxikált endotoxin oldatot DEAE cellulóz oszlopon is lehet átengedni azonos nyomás-viszonyok között, amelyet a Sephadex oszlopnál említettünk. Az átfolyási sebességet 2-15 ml/perc között tartjuk. Az alkalmazott oldószerek azonosak azzal, amelyet a Sephadex-oszlopnál alkalmazunk, bár víz és/vagy dietil-amin minden keverékhez adható kb. 1 % koncentrációig. Más módszer, amely alkalmas TDE előállítására nyers, detoxikált endotoxinból, lehet pl. az oldat átengedése kis nyomáson szilikagél—60 oszlopon, amelynek részecske-mérete 25 és 63 mikron között van, és amelyhez kloroformból, metanolból, vízből és ammónium-hidroxidból áiló oldószert ajkalmazunk. Az előnyös térfogat-arány ezekből a komponensekből az oldószerhez kb.50:25:4:2. A tisztított, detoxikált endotoxinban (TDE) nincs kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanoát, és foszfor-tartalma 350 és 475 nmól/mg, míg zsírsav-tartalma 1700 és 2000 nmól/mg között van. A jelen kompozíciót injekció fonnájában lehet beadni gyógvászatilag elfogadható közegben, mint pl. olaj-cseppes emulzióban, vagy fiziológiás konyhasó oldatban, és előnyösen közvetlenül a tumorba is be lehet adni az alábbiakban részletesen ismertetett körülmények között. A beadást el lehet végezni intravénás injekció, vagy intravénás infúzió fonnájában. A kompozíciót pl. liofílezési eljárás segítségével lehet stabilizálni, majd ebből az állapotból megfelelően visszanyerni a gyógyító képesség elvesztése nélkül. A TDE mennyisége állatok kezelésénél egy injekcióban 25-500 mikrogramm/ml között lehet, célszerűen 50 és 100 mikrogramm/ml között, és a PK mennyisége 25-500 mikrogramm/ml között lehet, célszerűen 25 és 500 mikrogramm/ml között. A biológiailag a tumorba injektált milliliterek számát a tumor mérete határozza meg a következő táblázattal összhangban: Az állatoknak beadott dózis a tumor mérete alapján Biológiailag injektált A tumor átmérője mennyiség (cm) (ml) 0- 1 0,5-ig 1- 2 0.5-2,5 2- 3 2,5-5 3- 5 5-10 5-8 - 10-15, 8-nál nagyobb • 15-20 Az injekciónként! maximális dózis kb. 10 milligramm TDE és kb. 25 milligramm PK, A kezelés menete 4—10 injekciót foglal magában, kb. két hetes intervallumokban beadva. A jelen kompozíciót megfelelő injekciós közegben, pl. fiziológiás konyhasó-oldatban közvetlenül adjuk be az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
