192585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított, detoxikált endoxint és egy mikroorganizmus piridin-pldható kivonatát tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 192 585 2 A jelen találmány tárgya eljárás tisztított, detoxikált endotoxint (TDE) valamely mikroorganizmus piridin-oldhaló kivonatával (PK) együtt tartalmazó gyógyászati kompozíció előállítására. A jelen kompozícióban használt TDE azzal jellemezhető, hogy nem tartalmaz kimutatható 2-keto-3-dezoxi-oktanoátort, míg foszfort 350 és 475 nmól/mg közötti mennyiségben, zsírsavakat 1700 és 2000 nmól/mg közötti mennyiségben tartalmaz. A PK 3—20 tömeg % fehérjét, 10—40 tömeg % cukrot és 35-60 tömeg % zsírsavat tartalmaz. A kompozíció hatásos a rákos tumorok csökkentésének és/vagy visszafejlesztésének elérésére melegvérű állatokban. Bizonyos baktériumok, mint pl. a Corynebacterium parvum, voltak már tárgyai olyan kísérleti munkának, amelyek célja az volt, hogy izolálják a tumor növekedés gátlásának indukálásáért felelős komponenst (lásd pl. Anti Tumor Activity and Lymphoreticular Stimulation Properties of Fractions Isolated from C. parvum (A C. parvumból izolált frakciók tumor-ellenes aktivitása és limforetikuláris stimulálási tulajdonságai), Cantrell és munkatársai: Cancer Research, 39, 3554-3563, 1979 szeptember). A tumor-ellenes aktivitásán kívül a C. parvum a limforetikuláris rendszer hatásos stimulátora, és így nem kívánatos növekedést okoz a lép és a máj súlyában, valamint blasztogenezisben. Felfedezték, hogy valamely mikroorganizmus, mint pl. a C. parvum piridinoldható extraktuma rendelkezik hatásos tumor-ellenes tulajdonságokkal a nélkül, hogy rendelkezne azzal a nem-kívánatos toxikus hatással, amely a korábbi ismeretek szerinti készítményekhez társult. Az Enterobacteriaceae családból, akár szülő, akár mutáns törzsből nyert endotoxikus extraktumok ismertek. Ezeket az extraktumokat különböző immunogén tumorok imrnunterápiájához használják (lásd Peptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig Line—iO Tumor with Endotoxins [A tengerimalac-10 tumor endotoxinokkal történő immunterápiájához szükséges peptidek), Ribi és munkatársai: Cancer Immunol. Immunother. 7. kötet, 43-58 (1979)]. Az endotoxinextrakturnokról azonban ismeretes, hogy nagyon toxikusak és ezért csak korlátozottan használhatók rákos tumorok kezelésében. Erőfeszítéseket tettek arra, hogy az endotoxinokat úgy detoxikálják, hogy tumor-visszafejlesztő képességük megmaradjon. Amint Ribi és munkatársai kimutatták, az endotoxinok detoxikálására ismert olyan kémiai eljárások, amelyek azért megőrzik az adjuváns hatást, mint pl. a szukcinilezés és ftálilezés, ebben az esetben csökkenést váltanak ki mind az endotoxicitásban, mind a tumor visszafejlesztő képességben. Ezért az eddig végzett kísérletek olyan endotoxin-termék nyerésére, amelynek tumor-visszafejlesztő képessége nagy, de toxicitása kicsiny vagy nincs is, nem voltak sikeresek. A jelen találmány tárgya egy olyan gyógyászati kompozíció előállítása, amely valamely mikroorganizmus piridin-oldható kivonatát egy tisztított, detoxikált endotoxinnal együtt tartalmazza. A jelen találmány másik tárgya eljárást szolgáltatni melegvérű állatokban és emberekben levő tumorok kezelésére valamely mikroorganizmus piridin-oldható kivonatát és egy tisztított, detoxikált endotoxint tartalmazó kompozíciót alkalmazva. Egy mikroorganizmus piridin-oldható kivonata (PK). A PK 3-20 tömeg % fehérjét, 10-40 tömeg % cukrot, és 35-60 tömeg % zsírsavat tartalmaz a C. parvum teljes sejttel kapcsolatban, és előnyösen 5 tömeg % fehérjét, 35 tömeg % cukrot és 55 tömeg % zsírsavat tartalmaz. Ahogyan itt alkalmazzuk, nincs korlátozás a cukrok alkalmazásával kapcsolatban: minden cukor használható. Ugyanez vonatkozik a zsírsavakra is: nincs korlátozás a zsírsavakkal kapcsolatban, amelyeket alkalmazhatunk. A fehérje amínosavakból és ammóniából áll, és az aminosavak pl. a következőket foglalják magukban, Beckman aminosav-analizátort használva fel a meghatározásokhoz Aszparagin 0,273 Treonin 0,108 Szerin 0,585 Muraminsav 0,219 Glutamin sav 0,267 Glicin 0,39 Alanin 0,173 Diamin o-pimelinsav 0,444 Izoleucin 0,121 Leucin 0,167 Fenilalanin 0,034 Hisztidin . 0,088 Lizin 0,544 Ammónia 0,524 A megadott mennyiségek tömeg %-ban vannak kifejezve, a teljes fehérje mennyiség 6,34 tömeg %-nak adódik. Bármely mikroorganizmus alkalmazható alihoz, hogy piridin-oldható extraktumot nyerjünk, ilyenek pl. a M. bovis BCG, M. phlei, M. smegmatis, M. kansasíi,Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Propionibacterium acnes II. típus, és Corynebacterium parvum. A Corynebacterium parvum és a Propionibacterium acnes II. típus különösen előnyösek. A mikroorganizmus teljes sejtjeit, előnyösen paszta formájában, piridinnel összekeverjük. Az így nyert keveréket szeparáljuk, hogy egy olyan felülúszó frakciót nyerjünk, amely a piridin-oldható kivonatot és a mara dék piridint tartalmazza. A maradék piridint előnyösen ismét szeparálási eljáráshoz használjuk fel a fentebb leírtak szerint, hogy a kívánt kivonat további mennyiségét nyerhessük. A piridint a kivonatból eltávolítjuk és a szárított kivonatot megfelelő folyadékkal, pl. desztillált vízzel szemben dializáljuk. A teljes sejtek vagy sejt-fragmens szenynyezések távollétét elektronmikroszkóppal igazoljuk. Az így nyert tisztított kivonatot ezután liofilezzük az ismert módszerrel, így stabil terméket nyerünk. A jelen találmánnyal összhangban előállított piridinoldható kivonatot TDE-vel kombináljuk, így olyan kompozícióhoz jutunk, amelynek jelentős tumor-ellenes aktivitása van a nélkül, hogy stimulálná a lép és a máj megnagyobbodásának indukcióját. Ha a piridin-oldható kivonatot vízben szuszpendáljuk, a szuszpenziót szeparálni lehet egy vízben oldható és egy vízben nem oldható frakcióra. A vízben oldható frakció a legkívánatosabb, mivel ezt könnyen lehet párénterálisan injektálni, ugyanakkor ez a készítmény megtartja a piridin-kivonat tumor-elleres aktivitását. Azok a tumorok, amelyeket ezekkel a készítményekkel kezelni lehet, magukban foglalják az állati tumorokat, mint pl. marha pikkelyes sejt karcinoma, marha fibroszarkóma, ló-szarkoid, ló-melanoma, ló pikkelyes sejt karcinoma, kutya emlő-tumorok, kutya-adenoma, kutya-melanoma, emberi tumorok, mint pl. melltumorok, tüdő-tumorok, végbél-tumorok, rosszindulatú 5 10 15 2t 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
