192545. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ß-oxo-Ó.karbamoil-pirrol-propionitril-származékok, valamint ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 192 545 4 Minden anyagnál három kamrát alkalmazunk, cs az inkubálásl 5 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. A sejtvándorlás kontrolljaként vizsgálati vegyületet nem tartalmazó sejtszuszpenziót alkalmazunk. Az inkubációs idő elteltével a szűrőt eltávolítjuk, fixáljuk és Weigert szerint vas-hematoxilinnal színezzük. A szűrő alsó felületének négy mezejét 320-szoros nagyítás melctl mikroszkóppal vizsgáljuk. A kemotaxiás aktivitás indexeként a négy mezőben megszámlált neutrofilek átlagát használjuk. A sejtek által közvetített immunitás növekedését in vivo BCG-immunizált artritiszes patkányokon a túlérzékenységi reakció késleltetésének mérésével lényegében a Current Therapeutic Research, 30, $ 34 (1981) szerint mérjük. 325-400 g súlyú, hím Charles River-patkényokat érzékennyé tettünk, melynek során minden kísérleti állat jobb hátsó mancsába Freund-adjuvánsban (Freund’s incomplete adjuvant) szuszpendált 250 pg Mycobacterium tuberculosis-t (Difco) injektáltunk. Az állatokat az adjuváns injekciót követő I8. napon 0,1 ml intradermálisan adagolt BCG-vakeinával immunizáltuk. A hatóanyagot orálisan, kukoricakeményítőszuszpenzióban adagoltuk. A kontroll állatokat csak kukoricakeményítővel kezeltük. Az állatokat a 29. napon bőrükön IO pg PPD ' (purified protein derivative) adagolva ellenőriztük, bőrreakció létrehozására. Az eritéma átmérőjét és a keményedési reakciót 24 órával az antigén-kezelés után határoztuk meg. Az eritéma átmérőjének csökkenése jelenti a megnövelt sejtimmunitást. A gyulladásgátló hatás kimutatására szolgáló patkányokon végzett karragenin mancs-ödéma vizsgálatot a következőképpen végezzük: 1 órával a hatóanyag orális adagolása után az egyik hátsó láb talpába 0,1 ml, 1 %-os karragenin-oldatot injektálunk. Meghatározott időközönként ezután megállapítjuk a kezelt és az ellentétes kezeletlen macs domborodása közötti különbséget, higany-kiszorításos módszerrel. A szokásos adjuváns artrilisz vizsgálatot, melyet az anti-arlritikus hatás kimutatására alkalmaztunk, lényegében a Proc. Soc. Exp. Biok, Meg., 137, 506 (1971) cikke szerint végezzük. A fenil-p-benzokinon által indukált vonaglási kísérletet, mely fájdalomcsillapító (antinociceptin) hatásjellemzője, a J. Pharmacol. Exp. Therap., 125, 237 (1959) alapján hajtottuk végre. Példaként említjük az 1. példa szerinti ß-oxo-a(fenil-karbamoil)-ß-(2-pirrolil)-propionitrilt, és a 2. példa szerinti ß-oxo-a-(4-kl0r-fenil)-ß-(2-pirrolil)propionitrilt, melyek 100 mg/kg orális dózisban patkányokon karragcninnel előidézett ödémával szemben az adagolás után 3 órával 46, ill. 63 %-os védelmet adtak. A 3. példa szerinti ß-oxo-ct-(2,4-difluor-fenilkarbamoil)-ß-(2-pirrolil)-propionitril 25 mg/kg orális dózis esetén 33 %-os védelmet eredményezett. Ezenkívül a találmány szerinti vegyületek például a fent említett 1., 2. és 3. példa szerinti vegyületek patkányokon a hagyományos adjuváns artrilisz vizsgálatban 25 mg/kg orális dózisban hatékonyak, és 47, 58, illetve 55 %-os védelmet nyújtanak. A találmány szerinti vegyületek például az előzőekben említett 1. és 2. példa szerinti vegyületek a BCG-immunizált adjuváns artrilisz patkányokon 25 mg/kg orális dózis mellett szignifikáns immunpoteneirozó hatást mutattak. Ugyancsak hatékonyak a találmány szerinti vegyületek a szinoviálís porcszővet-Co-tenyészet-rendszerben, mely a porc-mátrix-lebontás modelljének vizsgálatára szolgál. Ebből következtetni lehet a vegyületek osteoarthritisre kifejtett hatására. A kísérleti elrendezés a következő: Szarvasmarhák orr-elválasztó porcának proteoglitkán mátrixát a gliikóz-amino-glükánban történő 35S- beépítéssel in vitro megjelöltük. Erre a célra a porclemezkéket szulfát-mentes közegben. 35S-nátriumszulfáttal inkubáltuk. Ezután a 3 \S-jelzett porc-lemezkékel normál ízületi szövet cxplanlátuminal 4 napon át „Multi-Wcir’-szövcttcnycsztő lemezen tenyésztettük. Az inkubációs idő elteltével a közeg 100 pl-es alikvotjának radioaktivitását megmértük. Ezután a porc-lcmezkékct hidrolizáltuk, és ismét megállapítottuk a radioaktivitást. Ebből megállapítható, hogy a 3SS-jelzelt glükóz-amino-glükánok milyen része ment a Co. tenyésztés során a tápközegbe: a kezelt és kezeletlen (kontroll) tenyészetek összehasonlításából kiszámítható a mátrix-bomlás gátlása. Példaként az 1. példa szerinti ß-oxo-(fenil-karbamoi!)-ß-(2-pirrolil)-propionitril, a 2. példa szerinti ßoxo-a-(4-kl0r-fcnil-karbamoi!)-ß-(2-pirro!i!)-propionitril és a 3. példa szerinti ß-oxo-u-(2,4-dinuor-fcnilkarbamoil)-ß-(2-pirrolil)-propionitril- a porc-mátrixlebontást in vitro 10 és 10 közötti koncentrációtartományban gátolja. A fent említett tulajdonságai következtében a találmány szerinti vegyületek analgetikus, gyulladásgátló, artritisz-ellenes és immunpoteneirozó szerként hasznosak, és így főleg különböző eredetű fájdalmak és gyulladásos betegségek, pékiául reumatoid artrózisés oszteoartrózis kezelésére alkalmasak emlősökön, ideértve az embert is. A találmány szerinti vegyiileteket az önmagukban ismert módszerekkel például úgy állítjuk elő, hogy a) olyan (III) és (IV) általános képletü vcgyülctcket reagáltatunk, melyekben Py és Ph az előzőekben megadott jelentésű, vagy b) egy (VI) általános képletü vegyületet vagy ennek valamely reakcióképes funkcionális származékát egy H-NH-Ph (VII) képletü aminnal kondenzálunk, Py, és Ph az előzőekben megadott jelentésű, vagy c) egy (IX) általános képletü vegyületet, vagy ennek valamely reakciókcpes funkcionális származékát egy (X) általános képletü vegyiilcttcl kondenzálunk, Py, és Ph az előzőekben megadott jelentésű, és kívánt esetben, egy keletkezett enolt valamely bázissal alkotott sóvá, vagy egy keletkezett enol sót a szabad cnollá vagy valamely más bázissal alkotott sóvá alakítunk. Az a) eljárásban a reakciót - ahol (IV) általános képletü izocianátot és (III) általános képletü pirrolacetonitrilt reagáltatunk, a 4 256 759 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt módon végezhetjük. Ezek szerint egy szerves vagy szervetlen bázis, például nátrium-hidrid vagy trietil-amin jelenlétében vagy anélkül, vagy egy poláros oldószer, pékiául éter, például dietil-étcr, ctilénglikol-dimetiléter elegy (Glyme) vagy tetrahidrofurán és/vagy egy amid vagy szulfoxid, például dimetil-formamid vagy dimetil-szulfoxid jelenlétében vagy anélkül, előnyösen 25 °C és I00°C közötti hőmérsékleti tartományban, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
