192495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, alfa-amiláz-gátló polipaptidek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 192 495 6 lálmány szerinti amiláz-gátlók tehát terápiásán alkalmazhatók a cukorbetegség, a praediabetes és az elhízás kezelésére, továbbá a diéta elősegítésére. E célra javasolt a találmány szerinti gátló anyagoknak különösen az étkezések során való adagolása. Az adagolás - amely a beteg testsúlyától, továbbá az egyéni szükséglettől függ — dózisonként körülbelül 10 - 500 mg, amelyet célszerűen minden egyes étkezés alkalmával kell bevenni. Megfelelően indokolt egyes esetekben a dózis ennél magasabb vagy alacsonyabb is lehet. A találmány szerinti amiláz-gátlók különösen orális adagolásra alkalmasak. E célra alkalmazható a tiszta vegyület önmagában, vagy valamilyen gyógyszerkészítmény alakjában, amelyet a szokásos segéd- és vivőanyagok segítségével állítunk elő. Előnyös lehet továbbá a találmány szerinti vegyületek más gyógyszerekkel — például vércukorszint- vagy lipid szint-csökkentő hatóanyagokkal — kombinált alkalmazása is. Mivel nagy molekulasúlyú peptidek nem, vagy alig szívódnak fel az emésztőcsatornából, a találmány szerinti vegyületek várhatóan semmiféle toxikus mellékhatást nem idéznek elő. Mivel aminosavösszetételük nem tekinthető rendkívülinek, azért az esetleges proteolitikus hasadási termékeik fiziológiai szempontból közömbösek. Ennek megfelelően az Al- 3688 jelű anyag igen magas dózisai kísérleti állatokon semmiféle feltűnő tünetet nem idéztek elő. A találmány szerinti amiláz-gátlók farmakológiai vizsgálata céljából 200 - 250 g testsúlyú éheztetett hím Wistarpatkányoknak az AI-3688 jelű a-amiláz-gátló anyagot 2 g/testsúly-kg mennyiségű keményítővel egyidejűleg orálisan adagoltuk. Az a-amiláz-gátló anyag adagolása előtt, alatt és utána vett vérpróbák vércukor-koncentrációjának meghatározásával igazoltuk az AI-3688 hatásosságát. A vércukorszint szabályzása mellett a találmány szerinti polipeptidek a nyálban levő a-amiláz gátlásá ra is alkalmazhatók. Ennek az enzimnek a hatására emésztődik a szájban a keményítő, és az így képződő cukor sietteti a fogak szuvasodását. A találmány szerinti vegyületek ezért felhasználhatók a fogszuvasodás elhárítására vagy csökkentésére. A találmány szerinti vegyületek biokémiai reagensekként, valamint diagnosztikai szerekként is alkalmazhatók. Vizsgálat amilázzal Az amiláz-gátlás egysége (AIE) a gátló anyagnak az a mennyisége, amely a vizsgálati körülmények között két amiláz-egység 50 %-át gátolni képes. Nemzetközi megegyezés szerint egy amiláz-egység az enzimnek az a mennyisége, amely egy perc alatt I mikroegyenérték glukozidos kötést a keményítőben hasítani képes. A hasított glukozidos kötések mikroegyenértékmennyiségét a képződött redukáló cukor mikroegyenérték-mennyíségeként fotometriásan, dinitro-szali cilsav segítségével határozzuk meg. Az adatokat a maltóz. mikromöl-mcnnyiségébcn fejezzük ki, amelyet a maltózzal végzett kalibrálással kapott egyenesrői olvasunk le. A vizsgálatot a következőképpen hajtjuk végre: Sertés-hasnyálmirigyből származó a-amilázt és a vizsgálandó oldatot 1,0 ml 20 millimólos foszfátpufferben, amely 10 millimól nátriumkloridot is tartalmaz, és pH-értéke 6,9, 10-20 percen át 37 °C hőmérsékleten előinkubálunk. Az enzimreakciót 1,0 ml Zulkowski-féle oldható keményítő hozzáadásával (0,25 % a fentebb megadott pufferban) indítjuk meg. Pontosan 10 perc múlva a reakciót 2,0 ml dinitroszalicilsav fcstékreagens(Bochringer Mannheim: Biochcmica-lnformation II) hozzáadásával leállítjuk, és a szín kifejlesztése céljából 5 percig forró vízfürdőben melegítjük. Lehűtés után az extinkciót 546 nm hullámhosszúságon a reagens üres értékével összehasonlítva mérjük. Az 50 %-os gátlást a nem gátolt enzimreakcióval összehasonlítva különböző inhibitormenynyiségek alkalmazásával, a valószínűségi ábrázolás segítségével grafikusan határozzuk meg. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen ismertetjük. /. pel Ja Az AI-3688 jelű anyag előállítása céljából az oltóanyagot (a mikroorganizmus tenyésztését) a mikrobiológiai gyakorlatnak megfelelően - a Streptomyces aureofaciens FH 1656, DSM 2790 törzs liofitizálással tartósított formájából egykolóniás átvitellel, ferdekémcsöves tenyésztéssel kapjuk. A fermentációhoz szükséges spórák tömegtermelését Roux-lombikokban, szilárd táptalajon végezzük. Agar-agar táptalaj a lemezekhez, a ferdén elhelyezett kémcsövekhez és a Roux-lombikokhoz all Dextrin 15,0 Szacharóz 3,0 Húskivonat 1,0 Élesztőkivonat 2,0 Konyhasó 0,5 Dikálium-hidrogén-foszfát 0,5 Vas(!I)-szulfát-heptahidrál 0,01 Agar-agar 2,0 pH-érték 7,3 Sterilizálás 120 'C hőmérsékleten 20 perc Inkubálás 30 °C hőmérsékleten 9 napig A Roux-lombikokból a spórákat 100 ml steril vízzel leöblítjük, és Fernbach-lombikban vegetatív fermentációs előfokozat céljára átoltjuk. (A munkatérfogat L2 1.) A fermentációs előfokozat közege: 9/1 Glukóz 30,0 Szójaliszt 20,0 Kukoricakeményítő 2,0 Karbamid 1,0 Ammónium-nitrát 1,0 Malátakivonat 5,0 pH-érték 6,8 Sterilizálás 120 °C hőmérsékleten 20 perc Az inkubálást 28 °C hőmérsékleten 2 napon át rázógépen (150 percenkénti fordulatszántmal, 5 cm rázási amplitúdóval) végezzük 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
