192495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, alfa-amiláz-gátló polipaptidek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 192 495 8 A főfermentáció végrehajtása: 48 órás előtenyésztés után (lásd fentebb) 200 liter térfogatú főfermentációs közeget Fernbach-Iombikból vett 1,2 liter oltóanyaggal beoltunk. A főfermentáció közege: Oldható keményítő Glukóz Kazein-pepton Kukoricalekvárlé (folyékony) Szója liszt Diammónium-hidrogén-foszfát pH-érték Sterilizálás 120 °C hőmérsékleten éli 4.0 1.0 1.0 0,4 0,4 0,8 8,3 30 perc Az inkubálást 28 *C hőmérsékleten 5 m/scc kerületi sebességgel való keverés és 0,1 térf./térf. levegöztetési sebességgel 5 napon át végezzük. A fermentáció során a pH-érték csökken, ezért nátrium-hidroxid hozzá adásával 5,5 — 6,0-ra szabályozzuk. Öt nap után elvégezzük a feldolgozást. így a tenyészlőoldat I literére számítva 60 mg Al-3688 terméket kapunk. 5 10 15 20 2. példa 180 liter 1. példa szerinti fermentációs oldatot centrifugálás segítségével mentesítünk a sejttömegtől, és a tiszta folyadékfázist 4,9 pH-értékre állítjuk. Ezt követően az oldatot 15 liter polisztirol-alapú adszorbeiós gyantát (Diaion® HP-20) tartalmazó oszlopra visszük, 30 liter vízzel utánamossuk, és növekvő mennyiségű izopropanolt tartalmazó vízzel eluáljuk. A 25 % izopropanolt tartalmazó elegy az AI-3688 gátló anyagot leoldja az oszlopról. Ezt a 25 liter térfogatú aktív eluátumot ultraszűréssel betöményítjük, és víz hozzáadásával, valamint további ultraszűréssel addig sómentesítjük, amíg az így kapott folyadék kimutatható sómennyiséget már nem tartalmaz. Az így kapott 1,5 liter térfogatú koncentrátumot dietil-amino-etilcsoporttal módosított cellulózon (DEAE-Sephadex ), amelyet 1/15 mólos 5,6 pH-crtékü foszfát-pufTerrel kiegyensúlyozunk, elválasztásnak vetjük alá. Az n-amiláz-gátló aktivitást pótlólagos konyhasó-gradiens létesítésével eluáljuk. A megfelelő frakciókat sómentesítjük. Ezután a kapott oldatot ultraszűrő cellákben (Amicon®), amelyeket 1/15 mólos foszfátpuflerrel 1,6 pH-értékkel egyensúlyoztunk, töméijyítjük. Ezt követően pótlólagos konyhasó-gradiens létesítésével eluáljuk az a-amiláz-gátló-aktivítást. A megfelelő frakciókat sómentesítjük, és ismételten töményítjük az oldatot ultraszürő cellákban. A végső tisztítást poliakrilamid-gélen (Biogel P-6®) futtatószerként tiszta vízzel végezzük. Az oszlopról eltávozó AI-3688 terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. így 1,2 g színtelen port kapunk, amelynek a-amilázgátló hatékonysága milligrammonként 1,5 x 104 egység. 25 30 35 40 45 50 55 60 különbséggel, hogy az ott megadott 5 napos fermentáció helyett 8 napon át fermentálunk. A fermentációs oldat feldolgozását a 2. példa szerint végezzük. Az így kapott 0,9 g súlyú színtelen anyag kémiailag nem egységes. 100 mg így kapott port l ml 95 : 5 (térfogat/ térfogat) arányú víz-acetonitril elegyben oldjuk, és olyan acéloszlopra visszük fel (belső mérete 3,2 x 25 cm2), amely fordított fázisú Kieselgel RP18 töltetet tartalmaz. Az eluálást 95 : 5 arányú víz-acetonitril eleggyel végezzük, amelynek pH-értékét trifluor-ecetsavva! 2.1-re állítjuk. 7000 kPa nyomást létesítünk dugattyús szivattyúval, így az átfolyási sebesség percenként 8 ml-t tesz ki. Az oszlopról való kifolyást 276 nm hullámhosszúságú ibolyántúli fény elnyelése alapján vizsgáljuk. 41-43 perc elmúltával több abszorbeáló vegyidet távozik az oszlopról, ezeket külön-külön összegyűjtjük, n-amiláz-gátló hatásukat megvizsgáljuk, majd vákuumban bepároljuk, s utána liofilizáljuk. Az egyes frakciókat Beckmann-Sequencer 890 C műszerrel az egységesség szempontjából megvizsgáljuk, és utána az aminosavszekvenciát meghatározzuk. Az elemzés a következő eredményekhez vezetett: Az I. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amelynek szerkezete megfelel az (la) képletnek, azonban a 34-es helyzetű glutamin helyett glutaminsavat tartalmaz (ez az AI-3688c termék). A 2. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amelynek szerkezete az (la) képletnek megfelel, ez tehát az AI-3688 jelű anyag. A 3. csúcs olyan aminosavszekvenciát jelez, amely megfelel az (la) képletnek, azonban a !4-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688b termék). A 4. csúcs l-dez-alanin-AI-3688 terméknek felel meg (ez tehát az AI-3688a jelű termék). Az 5. csúcs két l-dez-alanin-A 1-3688 termék keveréke, az egyikben a 34-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688e jelű termék), a másikban a 14-es helyzetű glutamint glutaminsav helyettesíti (ez az AI-3688d termék). Valamennyi vegyület fajlagos cc-amiláz-gátló aktivitása l,5(±0,1) x 104 AlE/mg. 4. példa (A polipeptid gyűrűjének a hasítása; a hatás alapelvének az igazolása) 10 mg 2. példa szerint előállított AI-3688 terméket 5 ml, 7,0 pH-értékű foszfátpufiTerben oldunk. Egy kis próbát vizsgálat céljából kiveszünk, és 10 ml ditioeritritet adunk hozzá. Ezután 18 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, s utána a reakcióelegy a-amiláz-gátló hatását a kiinduló oldat gátló hatásával öszszehasonlítva megvizsgáljuk. Míg a kiinduló anyag 1,5 x I04 AlE/mg teljes aktivitást mutat, addig a reakcióelegy gátló hatása a kimutatási határt sem éri el. Szabadalmi igénypontok 3. példa Több komponenst tartalmazó AI-3688 inhibitorkomplexet az I. példa szerint állitu, k elő, azzal a 65 1. Eljárás az (la) képletü gyűrűs polipeptid és alábbi variánsai — az I. helyzetben nincs alanin, így az első aminosav a treonin, 5
