192495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, alfa-amiláz-gátló polipaptidek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 192 495 4 foszfát- vagy hidrogcn-karbonát-pulTcroldattal - vagy adott esetben vizet tartalmazó szerves oldószerekkel, példlul metanollal, ctanollal, acctonnal, előnyösen víztartalmú izopropanollai eluálva elkülönítjük. Az inhibitort tartalmazó eluátumokat ismert módon ultraszűréssel töményitjük, s ennek során egyidejűleg sómentesítést is végzünk. Az AI-3688 termék ionszegény vizes oldatát ioncserélő oszlopon ismert módon kromatografálva elválasztásnak vetjük alá. E célra előnyösen (dietil-amino-etil)-cellulózt vagy dietil-amino-etil-csoporttal módosított cellulózt (például DEAE-Sephadex® terméket) alkalmazunk ioncserélőként; alkalmazhatunk azonban számos más, kereskedelmi forgalomból beszerezhető kation- és anioncserélő gyantát is. Az elkülönítési eljárás utolsó lépése molekulaszita (például Biogel P-6'”1 vagy Sephadex*) alkalmazásában áll. A tiszta termék így kapott vizes oldatát például liolilizálás útján száríthatjuk. A szárazanyag fajlagos aktivitása milligrammonként 1,5 x 104 a-amiláz-inhibitor egység (gátlási egység). A tiszta AI-3688 jelű inhibitor színtelen polipeptid, amelynek aminosavelemzése a legtöbb természetes aminosav jelenlétét mutatja. Összetétele megfelel az fia) képletnek. Különösen hosszabb időtartamú fermentáció során előfordulhat, hogy a kapott AÍ-3688 inhibitor termék nem egységes. Ilyen esetekben az egyes komponenseket nagynyomású folyadékkromatográfiával lehet elkülöníteni: e célra előnyösen fordított fázisú („reversed phase”) RP 18 hordozóanyagot alkalmazunk, és az eluálást 95 : 5 arányú víz-acetonitril elegygyel végezzük. Az így kapott komponensek megfelelnek az AI-3688 a-g változatainak. E szerkezeti variánsok hatékonysága az Al-3688 jelű termékével azonos. Az AI-3688 jelű polipeptidre és az Al-3688 a-g szerkezeti variánsokra jellemző, hogy ezekből a metionin, izoleucin, leucin, lizin és hisztidin természetes aminosavak hiányoznak. Az Al-3688 vizes oldatban A.max = 275 nm-nél az ibolyántúli fényt elnyeli E|*c = 21 extirikciós értékkel. Az izoelektromos fokuszálással meghatározott izoelektromos pont 4,2. Az AI-3688 inhibitor vízben és vizes pufíeroldatokban jól oldódik, és oldékonysága csak az izoelektromos pont közelében csökken. A fentiekben megadott aminosavösszetétel és - önmagától értetődő módon - szerkezetük alapján az Al-3688 és annak a-g szerkezeti változatai az összes eddig ismert a-amiláz-gátló anyagoktól különböznek, tehát új anyagok. A kémiai szerkezet - amint ezt az (la) képletben ábrázoltuk — az Al-3688 aminosavszekvenciáján kívül egy gyűrű jelenlétét is mutatja, amely 17 aminosavból áll, és a 9-es helyzetű ciszteinnek a 25-ös helyzetű ciszteinne! való kapcsolódása hozza létre. P. Y. Chou és G. D. Fasmann (Advances in Enzymology, 47. kötet, 45- 148. oldal, kiadó: John Wiley and Son, 1978.) szerint a polipeptidek primer szerkezete — a polipeptidet felépítő egyes aminosavak és kapcsolódásuk térbeli sajátságainak, azaz sorrendjüknek cs gyürüképzésiiknek az alapján — lehetővé teszi, hogy a peptidek szekunder szerkezetére következtetéseket vonjunk le. Az Al-3688 inhibitor esetében elvégeztük a Chou — Fasmann elemzést. Ennek során meglepő módon azt találtuk, hogy a gyűrű -Ght-Ser-Trp-Arg-Tyr- rcsz-szckvcncia exponált helyen — azaz térelrendeződes szempontjából kiemelkedő helyen - biokémiai reakciókra alkalmas módon cpiil a molekulába, és végső soron ez felelős a halékgnyságért. Azt találtuk továbbá, hogy ha a 17 aminosavat tartalmazó gyűrűt - például a cisztin kén-kén (diszulfid) kötésének megszüntetésével — felnyitjuk, akkora térszerkezet megváltozik, ennek következtében a fenti, döntő jelentőségű rész-szekvencia térelrendeződés szempontjából már nem emelkedik ki, és ennek következtében az enzimgátló hatás veszendőbe megy. Az AI- 3688 a-amiláz-gátló anyag gyűrünyílás útján keletkező kémiai származékait biológiai és biokémiai szempontból hatástalanok (lásd a 4. példát). A találmány szerinti a-amiláz-gátló anyagokra és lényegében ezeknek az anyagoknak a gátló hatására jellemző, hogy egy nagy méretű, 17 aminosavbó! álló gyűrűt tartalmaznak, és ebben a gyűrűben jelen van a -Gln-Ser- Trp-Arg-Tyr- aminosavszekvencia. A rész-szekvencia összetétele — amint ezt a találmány szerinti polipeptidek mutatják - kevéssé befolyásolja az enzimgátló hatás erősségét. Nem lényeges továbbá a ciklusos peptid gyürüképzésének a jellege sem: a hatékonyság szempontjából közömbös a gyürüképzés kémiai kötésmódja vagy ennek biológiai vagy szintetikus úton való kialakítása. A lényeges annak a gyürűrendszernek a jelenléte, amely a fentebb megadott aminosavrész-szekvenciát tartalmazza. A 2 716 050 számú német szövetségi köztársaságbeii közrebocsátási iratban leírt, Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 törzsből elkülönített a-amilázgátló anyaggal végzett visgálatok azt mutatták, hogy a gátló hatásért a fentebb megadott rész-szekvencia, valamint egy gyürűrendszer jelenléte felelős. A vizsgálatot a következőképpen végeztük. A Streptomyces violaceoruber ATCC 31209 törzsből kapott a-amiláz-gátló anyag rész-szekvenciáját úgy állapítottuk meg, hogy reduktív vagy oxidativ gyürünyitással lineárissá alakítottuk, és a szekvenciát egy Beck ma n n-Seq uena tor* műszerrel 0,2 mólos pufferrendszerben (Quadrol®) az automatizált aminosav(fenil-tio-hidantoin) (PTH) módszerrel határoztuk meg. Az anyag két ciszteincsoportja között - többek között — a következő rész-szekvenciát találtuk:-Tyr- Phe-G/n-Ser-Trp-Arg-Tyr-Thr-Asp-Val-His-. A találmány szerinti gátló anyagok tulajdonságai a cukorbetegség és a praediabetes, valamint elhízás terápiás kezelése, továbbá a diéta elősegítése szempontjából figyelemre méltók. Sajátságaik alapján diagnosztikai célokra értékes reagensekként is számításba vehetők. A keményítőt tartalmazó élelmi- és élvezeti szerek mind az állatoknál, mind az embernél növelik a vércukorszintet, és ennek következtében a hasnyálmirigy inzulinelválasztásának fokozódását idézik elő. A hyperglykaemia (magas vércukorszint) úgy jön létre, hogy az emésztőcsatornában az amiláz és maitáz enzim hatására a keményítő glukózra hasad. Cukorbetegeknél a magas vércukorszint különösen kifejezett és tartós. Az étrend keményítőtartalma következtében beálló magas vércukorszint, valamint magas vér-inzulinszint a találmány szerinti amiláz-gátió anyagokkal, különösen az AI-3688 jelű polipeptid segítségével csökkenthető. E hatás függ az alkalmazott dózistól. A ta5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
