192495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, alfa-amiláz-gátló polipaptidek és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 192 495 2 A találmány új, biológiailag hatásos, gyűrűs polipeptidek előállítására vonatkozik. E polipeptidek gátolják az a-amiláz enzimet, s így az ember- és állatgyógyászatban, az orvosi diagnosztikában, valamint a keményítő biotechnológiájának területén alkalmazhatók. Közelebbről, a találmány tárgya eljárás a (la) képletü polipeptidek és variánsaik előállítására. A találmány szerinti polipeptidek a következők: — Az (la) képletü peptid (ez az alábbiakban AI- 3688 jelzéssel szerepel), valamint e peptid következő szerkezeti változatai: — az 1-dez-alanin-származék (jele AI-3688a), amelyben az 1 -es helyzetű alanin aminosav hiányzik, így az első aminosav a 2. helyzetű treonin; — az AI-3688b jelű peptid, amely az AI-3688-tól abban különbözik, hogy a 14-cs helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav; — az Al-3688c jelű peptid, amely az AÍ-3688-tó! abban különbözik, hogy a 34-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav; — az AI-3688d jelű peptid, amely az AI-3688a-tól abban különbözik, hogy a 14-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav és az 1-es helyzetű alanin aminosav hiányzik, igy az első aminosav a 2. helyzetű treonin; — az AI-3688e jelű peptid, amnely az AI-3688a-tól abban különbözik, hogy a 34-es helyzetű aminosav glutamin helyett glutaminsav és az 1. helyzetű alanin aminosav hiányzik, így az első aminosav a 2. helyzetű treonin; — az AI-3688f jelű peptid, amely az Al-3688-tói abban különbözik, hogy mind a 14-es, mind a 34-es helyzetű glutamin helyett glutaminsavat tartalmaz; és — az AI-3ó88g jelű peptid, amely az AI-3688f jelű peptid 1-dez-alanin-származéka. A peptidek 36, illetve 35 aminosavat tartalmaznak. Az aminosavszekvencia amin-terminálisán (aminocsoportos végződésen) az 1-es helyzetben alaninna! vagy a 2. helyzetben treoninnal kezdődik. Az AI-3688 pepiidben a 9-es helyzetű cisztein és a 25-ös helyzetű cisztein között diszulfidkötés van. A diszulfidkötések (diszulfidhidak) az AI-3688 szerkezeti változatainak (variánsainak) megfelelő helyein is megtalálhatók. E leírásban a gátló anyagokban levő aminosavakat azokkal a szimbólumokkal jelöljük, amelyeket L. Stryer: „Biochemistry” című könyvében (W. H. Freeman and Company, San Francisco, 1972, 14. és következő oldalakon) alkalmaz. A találmány tárgya az AI-3688 jelű polipeptid, valamint ennek AI-3688a-g jelű szerkezeti variánsai, valamint az e vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására szolgáló eljárás. A találmány szerint az (la) képletű polipeptideket úgy állítjuk elő, hogy egy Streptomyces aureofaciens törzset szubmerziós eljárással valamilyen fermentációs közegben tenyésztünk, a polipeptidct a micéliumból vagy a kultúraszűrletből ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk. Az AI-3688 jelű polipeptidet és ennek AI-3688a-g jelű szerkezeti variánsait előnyösen a Streptomyces aurefaciens FH 1656 törzs miciéliumából és kultúraszürletéből kapjuk. Ezt a törzset a Mikroorganizmusok Német Gyűjteményében [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)] 1983. december 02-cn DSM 2790 törzskönyvi számmal helyeztük letétbe. Az AI-3688 jelű polipeptid és szerkezeti variánsainak előállítására azonban ennek a törzsnek a variánsai és mutánsai is felhasználhatók. A Streptomyces aureofaciens DSM 2790 törzs taxonómiai sajátságai megfelelnek a Streptomyces aureofaciens „Bergey's Manual of Determinativa Bacteriology” (8. kiadás, Williams és Wilkins Corp. kiadása, Baltimore, 1974) kézikönyvben levő leírásának. A leírt törzsek közötti különbség az anyagcsere terméké ben áll. Mindeddig nem ismertettek olyan gyűrűs peptideket, amelyek Streptomyces aureofaciens törzsek anyagcseretermékei: így tehát a törzs új. Az AI-3688 jelű polipeptid előállítására célszerűen a következőképpen járunk el: A Streptomyces aureofaciens DSM 2790 törzset vizes lápközegben, süllyesztett módszerrel (szubmerziósan), előnyösen aerob körülmények között addig tenyésztjük, amíg az AI-3688 kielégítő koncentrációt ér el. A táptalaj egyrészt szénforrásokat — például szénhidrátokat - másrészt nitrogénforrásokat — például alkalmas nitrogénvegyületeket, igy fehérjetartalmú anyagokat — tartalmaz. Szénforrásként alkalmas vcgyülclck például a glukóz, szacharóz, glicerin, malátakivonat, keményítő, olajok és zsírok. Nitrogénforrásként előnyösen alkalmazható vegyületek például a kukorica duzzasztására felhasznált víz (kukoricalekvár), élesztőkivonatok, szójaliszt, halliszt, sovány tejpor, emésztett kazein, valamint húskivonat. Alkalmazhatók továbbá úgynevezett „szintétikus” táptalajok is. Hasznosnak bizonyulhat továbbá nyomelemeknek - így cinknek, magnéziumnak, vasnak, kobaltnak vagy mangánnak - a fermentációs közeghez való hozzáadása. Az AI-3688 képződéséhez vezető fermentáció széles hőmérsékleti határok között végezhető. E hőmérsékleti határok például 10 ”C és 40 °C; előnyösen körülbelül 25 °C és 35 °C közötti hőmérséklettartományban dolgozunk. A közeg pH-értékét úgy szabályozzuk, hogy ez a mikroorganizmusok szaporodásának megfeleljen: például 4,0 és 9,0, előnyösen*5,0 és 8,0 közötti pH-értéken dolgozunk. A tápközegtől függően, például a tápközeg minőségi és mennyiségi összetételétől, valamint a fermentáció körülményeitől, így a levegőztetés sebességétől, a hőmérséklettől és a pH- értéktöl függően az AI-3688 jelű polipeptid képződése a tápközegben általában 2—10 nap alatt következik be. Az Al-3688 a fermentációból származó micéliumban és kultúraszürletben egyaránt jelen van: főtömege általában a kultúraszürletben található. Ezért előnyösen úgy járunk cl, hogy a vizes fázist a micéliumlól például szűrés vagy centrifugálás útján elválasztjuk, majd az AI-3688 terméket mindegyik fázisból ismert eljárással elkülönítjük és tisztítjuk. E célra számos eljárás áll rendelkezésre: így például ioncserélők segítségével, molekulaszitákkaí vagy adszorbeáló gyantákkal végzett kromatográfia, kristályosítás, oldószeres vagy sókkal végzett kicsapás, ultraszürés, és Craig - féle megoszlatási eljárás. Az AI-3688 jelű termék elkülönítését előnyösen úgy végezzük, hogy a kultúraszűrletből megfelelő gyantás — így például poiiszlirol-alapú gyári ári - adszorbeáljuk, a terméket tartalmazó gyantát elkülönítjük, és az AI-3688 terméket alkalmas piifTeroldatokkaS igy 5 10 15 70 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
