192472. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (E)-5-(2-bróm-vinil)-uracil származékok előállítására
1 192 472 2 A találmány szerinti eljárás (v) lépésében a kiindulási (E)-5-(2-bróm-vinil)-2,2’-anhidro-l-(j3-D-arabinofuranozil)-uracilt rendszerint szobahőmérsékleten reagáltatjuk az X-Z általános képletű vegyülettel. A reakciót bázikus kondenzálószer, például piridin jelenlétében végezhetjük, ami adott esetben a reakcióközeg szerepét is betöltheti. Az így kapott védett vegyületeket a korábban ismertetett körülmények között acilezzük (IV) vagy (V) általános képletű vegyületekkel, majd a védőcsoportot például savas kezeléssel hasítjuk le. az (I) általános képletű vegyületeket ismert módon, a megfelelő savakkal reagáltatva alakíthatjuk át gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós sóikká, illetve a só formájában kapott (I) általános képletű vegyületekből lúgos kezeléssel szabadíthatjuk fel az (I) általános képletű bázisokat. Miként már közöltük, az (I) általános képletű vegyületek és gyógyászatilag alkalmazható savaddíciós sóik antiherpetikus hatással rendelkeznek. A vegyületek antiherpetikus hatását a következőképpen vizsgáltuk: A vizsgálatokhoz a Herpes simplex vírus 1-es és 2-es típusú törzseit (HVS-1 (HIL), illetve HVS-2 (NAH) használtuk. A vírustörzsek generációs ideje a vizsgált rendszerben 24-26 óra, titerük 106 TCIDS0 volt. A vizsgálatokhoz szövetkultúraként humán embrióból származó, diploid kromoszómaszámú fibroblaszt-tenyészetet használtunk. A frissen izolált sejteket a nyolcadik szubkultúra kialakításakor folyékony nitrogénben lefagyasztva tároltuk. Az innen felolvasztással kapott sejteket folyamatos szubkultúrák létesítésével tartottuk fenn. Ezeken a sejteken mind a HVS-1, mind a HVS-2 vírustörzs jól szaporodik. A szövetkultúrákban mycoplasmákat nem észleltünk. A vizsgálatokhoz tápfolyadékként Gibco gyártmányú, MÉM jelű, „Minimal Essential Eagle with Earles Salts” nevű táptalajt használtunk, amit 10 térfogat % újszülött borjú savóval, 10 mg/ml penicillinnnel és 100 mg/ml streptomycinnel egészítettük ki. A tápfolyadék pH-ja 7,4 volt. A vírustörzsek propagálása során a sejtek fiatal, közel konfluens kultúráit kis multiplicitással (0.01 TCEDS0/sejt) fertőztük. A vírusokat 2 órán át 37°C- on végzett inkubálással adszorbeáltattuk, a nem ad- 5 szorbolódott vírusokat dekantálással eltávolítottuk, és a sejttenyészetre friss tápfolyadékot töltöttünk. A 75%-os citopatogén hatás kialakulása után a sejteket háromszori olvasztással-fagyasztással feltártuk, majd a sejttörmeléket 15 percig 30 000 fordulat/perc sebes- 10 séggel végzett centrifugáldssal eltávolítottuk. Az így kapott vírusszuszpenziót felhasználásig —70 °C-on tároltuk. A vírusszuszpenziók infektív egységtartalmát a következőképpen határoztuk meg: A vírusszuszpenzió- 15 hói a fenti összetételű tápfolyadékban 10-es léptékkel hígítási sort készítettünk. Minden egyes hígítással négy-négy sejttenyészetet fertőztünk meg. A vírus titerét az a legnagyobb hígítás - az a vírusdózis - jelenti, amely a beoltott sejttenyészetek 50%-ábar, 20 hoz létre citopatogén hatást (TCIDS 0). Az (I) általános képletű vegyületek in vitro körülmények között kifejtett vírusellenes aktivitásának meghatározása során azt mértük, hogyan módosítja a vizsgált vegyület a vírus infektív titerét. A vírus- 25 szuszpenzió 10-es léptékű hígitásait 2 órán át 37 °C-on adszorbeáltattuk a sejttenyészeteken. A nem adszorbeálódott vírusokat foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldattal (pH = 2,4) lemostuk, és az így megfertőzött sejttenyészetekre a vizsgálandó ve- 30 gyületek tápfolyadékkal készített, különböző koncentrációjú oldatait vittük fel. Minden egyes vírusliígítással négy-négy sejttenyészetet fertőztünk. Az inkubációs idő addig tartott, amíg a kezeletlen, de vírussal fertőzött sejttenyészetekben (azaz a kont- 35 rollokban) a vírus a maximális titerét elérte. Ezzel a módszerrel meghatároztuk azt a legkisebb vegyületkoncentrációt, amely a vírus TC1D50 egységekben kifejezett titerét 1 log egységgel csökkentette. Az így kapott minimális gátló koncentráció-érté- 40 kék a vizsgált körülmények között jól jellemzik a vegyületek hatásosságát, és összehasonlításra is lehetőséget adnak. A mért értékeket az I. táblázatban közöljük. I. táblázat Hatóanyag Minimális gátló koncentráció Mg/ml HSV-1 (HIL) HSV-2 (NAH) (E)-5 -(2-b róm-vinil)-dezoxi-uridin (összehasonlító anyag) 0,1 (E)-5-(2-bróm-vinil)-2,2’-anhidro-l-(/3-D-arabinofuranozil)-uracil 1,0 25 (E)-5-(2-bróm-vinil)-2,2’-anhidro-3’-acetil-1 -(/3-D-arabinofuranozil)-uracil. HCL 0,5 25 (E^S-^-bróm-viniO^^’-anhidro-S’, 5’ -diacetil-1 -(j3-D-arabinofuranozil)-uracil 2,5 50 3
