192255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás háziállatok vérvizsgálatával emberi fogyasztásra kerülő termékek minősítésére és minőségének előrejelzésére
1 192 255 2 Példa A kortizol meghatározása háziállatok véréből A találmány szerinti eljárás alkalmas pl. sertések esetében a különböző tartási körülmények, valamint a szállítások során érvényesülő stresszhatások kimutatására. Megvizsgáltuk például, hogy „nemzsúfolt”, „zsúfolt-jó-mikroklímájú”, illetve „zsúfolt-rossz-mikroklímájú” tartási körülmények miként befolyásolják azonos sertésfajtán belül a stresszhormon vérszintjét. Vizsgáltuk továbbá azt is, hogy miként befolyásolja a gépkocsin történő szállítást - mint stressz szituáció - a vér hormontartalmát. A vizsgálatok összesen 350 állat felhasználásával történtek. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy az állat bármely hozzáférhető anatómiai régiójából nyert ismert térfogatú (20,0-50,0 p) vérmintát (pl. kapillárisvért) szűrőpapírra (pl. FN1, NDK, Schleicher- Schüll 2043a, Whatman No 4, vagy hasonló fizikai állandókkal rendelkező laboratóriumi szűrőpapír) cseppentjük, és szobahőmérsékleten hagyjuk beszáradni (kb. 30 perc). Az ily módon tárolt és/vagy szállított (pl. levélborítékban postai úton) minták a környezet hőmérsékletén, erős fénytől óvott helyen legalább 30 napig bomlást nem szenvednek, hormontartalmuk nem változik. A laboratóriumba beérkező szűrőpapírból a foltokat kivágjuk, és kémcsőbe aprítjuk. A csövekbe ismert térfogatú (pl. 1,0 ml) eluens oldószert mérünk. A csöveket vízfürdőn (kb. 50-60 °C) kb. 60 percig állni hagyjuk, ezt követően kb. 30 percig szobahőmérsékleten rázógépen enyhén rázzuk. Az eluens oldószer vizes oldat, a hormon leoldásához szerves oldószert nem kell tartalmaznia (pl. foszfát puffer, 0,05 mólos, pH 7,3, amely 1,0 g/Iiter marha szérum albumint tartalmaz). Lényegében olyan puffer oldat, amelyben az immunoassay adott hormon esetében kivitelezhető. A radioimmunoassay kivitelezése: Az eluátum általában 200 p alikvotjaihoz hozzáadjuk az antiszérum pufferes oldatát, valamint a radioaktív kortizol pufferes oldatát (pl. 10-20 000 dpm tríciummal vagy 125J-dal jelzett kortizol). Vortex keverőn megkeverjük, majd az egyensúly beálltáig inkubáljuk (pl. 30 percig 37 °C-on, utána 30 percig 4 °C-on, vagy éjjelen át 4 °C-on). Ezután az antiszérumhoz kötött és a szabad hormonfrakció szétválasztása céljából a csövekhez csontszén-dextrán szuszpenziót és polietilénglikol oldatot adunk, és kb. 10 perces inkubálás után (4 °C) hűtött centrifugában 10 percig kb. 2-3000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot dekán táljuk. Tríciummal jelzett kortizol alkalmazása esetén a felülúszó folyadékhoz (kötött frakció) PPO + POPOP toluol-dioxános oldatát mérjük, és a radioaktivitást folyadék-szcintillációs spektrométerben meghatározzuk. 125J-jelzett kortizol használata esetén a centrifugálással kiülepített frakció (szabad) radioaktivitását gammaspektrométerben mérjük. A vérminta szteroid tartalmának mennyiségi meghatározásához kortizol-standardból kalibrációs görbét készítünk (általában 0,1-14,0 pmól tartományban). E minták esetében is elvégezzük a radioimmunoassayt oly módon, ahogyan azt fent leírtuk. A vérminták hormontartalmának számítása A kalibrációs görbét logit-log transzformációval linearizáljuk. A görbéről leolvasott értékeket a vértérfogatok figyelembevételével korrigáljuk. Ily módon az értékeket nmól/liter dimenzióban kapjuk. Az eredmények számítása programozható asztali kalkulátor vagy bármilyen számítógép alkalmazásával megkönnyíthető. Eredményeink szerint a különböző tartási körülmények a vér kortizol tartalmát a következőképpen befolyásolták : „Nem-zsúfolt” 35,2 ± 6,8 nmól/1 „Zsúfolt-jó-mikroklíma” 45,3 ± 6,8 nmól/1 „Zsúfolt-rossz-mikroklíma” 80,5 ±16,9 nmól/1 Mint az eredményekből látható, a tartási körülmények romlása jelentős növekedést eredményezett a vér kortizol-tartalmában, amely - mint ismeretes - a húsminőség romlását eredményezi. Eredményeink szerint továbbá a szállítás, mint stressz szituáció, a vér kortizol-tartalmát a következőképpen befolyásolta: Szállítás előtt a gazdaságban 47,0±4,3 nmól/I Szállítás után a vágóhídon 215,2±8,3 nmól/1 Mint eredményeinkből kitűnik, a szállítás a hormonszintet drámai módon befolyásolta. Az antiszérum előállítása Az alkalmazott antiszérumot nyulak immunizálásával állítottuk elő. Mivel a kortizol relatíve kis molekulatömege miatt nem immunogén, a kortizolt nagy molekulatömegű fehérjéhez kötöttük. Az immunizálás történhet pl. kortizol-21-hemiszukcinát-marha-szérum-albumin vagy kortizol-3-karboxil-metiloxim-marha-szérum-albumin antigénnel. Az ily módon történő immunizálás után 3-9 hónap múlva nyerünk megfelelő tulajdonságú (titerű, specifikusságú, érzékenységű, affinitású) antiszérumot, amelyet mélyhűtött vagy liofilizált állapotban tárolunk felhasználásig. Megjegyezzük, hogy a mellékvese eredetű stresszhormonok meghatározására kidolgozott eljárásunkat a kortizol példáján ismertettük. Mivel egyes fajok fő kortikoszteroid hormonja nem a kortizol, hanem a kortikoszteron (pl. szárnyasok), e faj vizsgálatához utóbbi meghatározására van szükség. A kortizol esetében bemutatott eljárás pontosan a példában leírtak szerint alkalmas a kortikoszteron meghatározására is vérből. A különbség kizárólag az, hogy ez esetben kortikoszteron standardokat, radioaktív (3H vagy 125J jelzett) kortikoszteront, és erre a hormonra érzékeny antiszérumot kell fent ismertetett körülmények között alkalmazni. A kortizol-módszer ismertetése során leírt antiszérum előállításával megegyező módon kortikoszteron antiszérumot is fejleszthetünk nyulakban, vagy mindkét hormonmeghatározáshoz antiszérumot más emlősökben. A nyert antikortikoszteron 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60-55 4
