192245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok által termelt korrinoidok átalakítására ciano korrinoidokká
192 245 2 vagy egyszerű keverés útján. Ez a művelet olyan rövid időt igényel, hogy a hidroxo-korrinoidok bomlása ez alatt még nem következik be. Az adszorbensre kötött korrinoidokat a számított ekvivalens mennyiség 1,1-2,0-szeres feleslegének megfelelő mennyiségű cianid-ionokat tartalmazó híg vizes oldattal ciano-korrinoidokká alakítjuk, majd a felesleg, le nem reagált cianid-ionokat vízzel kimossuk, ezután a ciano-korrinoidokat ismert módon az adszorbensről leoldjuk. Az így nyert oldat az összes korrinoidot stabil ciano-alakban tartalmazza és szabad cianid-ionokat gyakorlatilag nem tartalmaz. A találmány szerinti új eljárás előnyei : 1. Az eddig ismert eljárásokhoz viszonyítva két nagyságrenddel csökken az átalakításhoz szükséges cianid-ionok mennyisége. 2. Ipari méretű megvalósításra igen alkalmas és gazdaságos az eljárás, mert : a hatóanyag adszorpciója, tisztítása, ciano-korrinoiddá alakítása és eluálása folyamatos eljárásban is jó hatásfokkal folytatható le; költséges cianid-mentesítő eljárásra és berendezésre nincs szükség; a technológiai folyamatok sorrendje a biztonságtechnikai feltételeknek megfelel, mert kizárja a hidrogén-cianid felszabadulásának a lehetőségét is, ugyanis semleges pH-értéknél végezzük a cianokorrinoidok kialakítását. 3. Az adszorbensről leoldott termék gyakorlatilag nem tartalmaz szabad cianid-ionokat. Ez különösen abban az esetben bir jelentőséggel, ha a nyers terméket további tisztítás nélkül takarmánykiegészítőként kívánjuk alkalmazni. 4. Az eljárás alkalmazása esetén a hulladékként jelentkező, csatornába vagy élővízbe leengedésre kerülő szennyvízben a cianid-ionok mennyisége nem haladja meg a megengedett értéket, így a környezetvédelmi követelményeknek megfelel. 1. példa A 159 356 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint félfolyamatos eljárással készített, az Országos Közegészségügyi Intézetben 76, 77, 78 és 79 szám alatt deponált Corynebacterium sp.-t (jelzése 34A1), Corynebacterium sp.-t (jelzése 244 Cl), Lactobacillus sp.-t (jelzése 244B Cl) és Propionibacterium sp.-t (jelzése 239 Al/6) tartalmazó metántermelő, vegyes mikropopulációjú fermentlé 1 m3-ét, amely pH-ja 6,3 és összesen 50 g korrinoidot tartalmaz, kénsavval pH 4,0-re állítjuk, felmelegítjük és 10 percig 100 °C-on tartva a sejteket feltárjuk és a korrinoidokat oldatba visszük. Az oldat 24 g hidroxokobalamint és 23,5 g rokon korrinoidot tartalmaz. A feltárt fermentlevet mozgóágyas technológiával alulról felfelé átvezetjük 20 liter Diaion HP 20 (Mitsubishi) makroretíkuláris adszorpciós gyantát tartalmazó oszlopon. Ekkor a fermentléből a korrinoidok megkötődnek a gyantán. A sejt törmeléket, a szerves és szervetlen kísérő anyagokat a megkötéssel azonos irányban vízzel kimossuk a gyanta oszlopból. Ezután az oszlopra 20 liter, öszszesen 3,0 g kálium-eianidot (1,25-ekvivalens) tartalmazó vizes oldatot nyomatunk fel. 10 perc állás után leengedjük az oszlopról a kálium-cianidtartalmú vizet és 100 liter vízzel átmossuk a gyantaoszlopot. A ciános kezeléshez alkalmazott és a gyanta oszlopról leengedett oldatot egyesítjük a vizes mosófolyadékkal. Az összesen 120 liter térfogatú oldat literenként 0,15 mg szabad cianid-iont tartalmaz. Az adszorpciós gyantáról a ciano-korrinoidokat 100 liter metanollal oldjuk le, felülről történő folyamatos rávezetéssel. A metanolos eluátumból a metanolt vákuumban 50 °C-t meg nem haladó hőmérsékleten lepároljuk. A vizes oldat 20,5 g cianokobalamint és 20,0 g egyéb ciano-korrinoidot tartalmaz. A termékben nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a hidroxokobalamin tartalom 0,5% alatt van. Szabad cianid-ionok nyomokban sem mutathatók ki. Szárítás után a termék takarmánykiegészítőként alkalmazható. 2. példa Az első példában megadott módon, az ott említett mikroorganizmusokkal készült fermentlé 100 literét dolgozzuk fel, amely 5,0 g korrinoidot tartalmaz. A fermentlevet a következő módon tárjuk fel : a fermentléhez 0,86 kg dinátrium-hidrogén-foszfát. 2 H20-t, 1,1 kg citromsavat és 1,0 kg nátriummetabiszulfitot adunk, majd autoklávban 10 percig 120 °C-on tartjuk. Az elegy 2,3 g szulfito-kobalamint és 2,42 g rokon szulfito-korrinoidot tartalmaz. Lehűtés után a csapadékos elegyet alulról felfelé átáramoltatjuk 3 liter Amberlite XAD 2 (Rohm and Haas) makroretíkuláris adszorpciós gyantából készült oszlopon. A szulfito-korrinoidok megkötődnek az adszorpciós gyantán. A fermentlé nyomait alulról felfelé áramoltatott vízzel kimossuk a gyanta-oszlopból. Ezután a gyanta-oszlopon 2 ágytérfogat/óra sebességgel 15 liter olyan vizes oldatot áramoltatunk felülről lefelé, amely összesen 0,5 g kálium-cianidot tartalmaz (2 ekvivalens). Ekkor a gyantán adszorbeált szulfito-korrinoidok jellegzetes sárgás vörös színe a ciano-korrinoidokra jellemző élénk lilás-vörös szinűvé változik. A káliumcianidos vizes oldat után 45 liter vizet áramoltatunk át az oszlopon felülről lefelé a cianid ionok kimosása céljából. Az átfolyt levet egyesítjük a vizes mosóval. Ennek szabad cianid-ion tartalma 0,12 mg/liter. A gyanta-oszlopról a korrinoidokat 10 liter 80 tf%-os vizes metanollal oldjuk le. A metanolos eluátumot vákuumban metanolmentességig bepároljuk. A kapott vizes oldat 1,92 g cianokobalamint és 2,01 g rokon ciano-korrinoidot tartalmaz. A nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatok szerint szulfito- vagy hidroxo-korrinoidok gyakorlatilag nincsenek jelen. Ugyanakkor nincs benne szabad cianid-ion. 3. példa Propionibacterium sp. (jelzése OKI 239 Al/6) mikroorganizmussal lefolytatott aszeptikus fermentáció útján kapott 100 liter fermentléből a kor-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
