192245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikroorganizmusok által termelt korrinoidok átalakítására ciano korrinoidokká
1 192 245 2 A találmány tárgya új eljárás mikroorganizmusok által termelt korrinoidok átalakítására cianokorrinoidokká. A korrinoidokat eddigi ismereteink szerint kizárólag mikroorganizmusok termelik; ezek sejtjeiben a korrinoidok koenzim formában, illetve fehérjéhez kötötten keletkeznek. A korrinoidok kinyerésének első lépéseként a sejteket fel kell tárni és a koenzim- B12 korrinváz-dezoxiadenozil csoportja és a fehérjék közötti kötéseket meg kell bontani. [Ullmann: Encyklopedie der Chemischen Technology 18. kötet, 214. oldal, 1967.] Ha a sejtek feltárását cianidszulfit- vagy nitrit-ionok jelenlétében végzik, a koenzim-forma a megfelelő ciano-, szulfito- vagy nitrito-korrinoiddá alakul át ; az említett ionok távollétében hidroxo-korrinoidok keletkeznek. Ismert, hogy a korrinoid-komplexek stabilitása különböző. Egymáshoz képest a stabilitás csökkenő sorrendje a következő: ciano-, szulfito-, nitrito-, hidroxo-korrinoid. A hidroxo-korrinoidok oly mértékben instabilak, hogy az eddig ismert eljárások már a feldolgozás első lépésében biztosították a stabilabb ciano- vagy szulfito-korrinoid kialakítását. A stabil ciano-korrinoidok kialakítása általában cianid-ionok jelenlétében végzett feltárással végezhető el. A feltárás, a fehérje-kötésből történő felszabadítás és a stabil ciano-korrinoid kialakítás ismert eljárásait a következő monográfiák foglalják össze : E. L. Smith: Vitamin BI2 Ed. Methuen’s, 1965. 15, 26-28. old., Pawelkiewicz: Vitamin B12 und Intrinsic Factor, Enke Verlag Stuttgart, 1962. 280. old.; W. Friedrich: Vitamin B,2 und verwandte Corrinoide (R. Ammon: Fermente, Hormone, Vitamine III/2), 10-13, old. G. Thieme Verlag, Stuttgart 1975. Minthogy az eljárás végső célja ciano-korrinoidok előállítása és a fermentlevek ipari feldolgozása esetében nagy térfogatokkal és olyan szennyező anyagok jelenlétével is kell számolni, amelyek szintén reagálhatnak a cianid ionokkal, a ciano-korrinoidok kialakításához a jelenlevő hidroxo-korrinoidok ekvivalensének sokszorosát kell alkalmazni. Ez biztonságtechnikai és környezetvédelmi szempontokból igen nagy problémát jelent. A 171 339 sz. magyar szabadalmi leírás szerint a sejtek feltárásakor és a korrinoidok fehérjekötésből való felszabadításakor a fermentlé B,2-vitamintartalmára számított ekvivalens mennyiség 100-600-szorosának, előnyösen 200-400-szorosának megfelelő feleslegben alkalmazzák a cianidiont. A fermentlé cianid-ionokkal való kezelését 10-300, előnyösen 20-120 percig végzik. A 2 530 416 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerinti eljárásban a B12-vitamint termelő mikroorganizmusok tenyésztésével nyert fermentációs levet vagy az abból nyert koncentrátumot cianid-ionokat leadó vegyülettel, például valamely ionosán disszociáló ciánhidrogén-sóval kezelik. A 2 209 842. sz. francia szabadalmi leírás szerint 5% nátrium-metabiszulfit jelenlétében 60-70 °C-on tárják fel a Propionibacterium sejteket. Az így nyert szulfito-korrinoidokat oldószeres extrakciós tisztítás után a B12-vitamin-tartalomra számított ekvivalens mennyiség 10-szeresének megfelelő kálium-cianid-felesleg jelenlétében 15 percig 60 °C-on reagáltatva nyerik a ciano-korrinoidokat. Acetonból történő kristályosítás után a tennék 10 ppm szabad cianid-iónt tartalmaz. Az ismert eljárások hátránya, hogy ipari méretben történő fermentlé-feldolgozás esetében igen nagy mennyiségű cianid-iont igényel. Ez jelentős biztonságtechnikai és környezetvédelmi problémákkal jár. Másik hátrányuk, hogy a nyers termék szabad cianid-ionokat tartalmaz. Ez utóbbi tény kristályos korrinoidok előállítása esetén nem hátrány, mert a tisztítási lépések során ez elkülöníthető a korrinoidoktól. Ha azonban a nyers terméket takarmánykiegészítőként kívánjuk alkalmazni, a megengedhető szabad cianid-ion tartalom korlátozott. Munkánk során a stabil ciano-korrinoidok kialakításának olyan módját találtuk, amely a fenti problémákat kiküszöböli. Az eljárás elve a következő: A mikroorganizmus sejtek feltárását és a fehérjekötésben levő korrinoidok felszabadítását ismert módon szulfit-ionok jelenlétében vagy enélkül és/ vagy hőkezeléssel végezzük, majd az oldatban levő korrinoidokat adott esetben ismert tisztítási lépések elvégzése után valámely alkalmas makroretikuláris adszorbensen vagy kationcserélő gyantán megkötjük ; az adszorbensre vagy ioncserélőre való kötés stabilizálja a hidroxo- vagy szulfito-korrinoidokat. Az adszorbens, illetőleg az ioncserélő felületén kötött korrinoidokból a stabil ciano-korrinoidok kialakítását magán az adszorbensen, illetőleg ioncserélőn végezzük a korrinoidok mennyiségére számított ekvivalens cianid-ionok vagy cianidionokat leadni képes vegyület, például valamilyen ciánhidrin 1,1-2,0-szeres feleslegével. Ez a reakció az adszorbens, illetőleg kationcserélő felületén pillanatszerűen végbemegy. A cianid-ionok nem reagált feleslege az adszorbens, illetőleg kationcserélő mosása útján eltávolítható, így az adszorbensről, illetőleg kationcserélőről leoldott ciano-korrinoidok nem artalmaznak szabad cianid-ionokat. A találmány tehát olyan új eljárás mikroorganizmusok által termelt korrinoidok átalakítására ciano-korrinoidokká cianidokkal való reagáltatás útján, melyre jellemző, hogy az ismert módon, célszerűen hőkezeléssel, szulfit-ionok jelenlétében vagy enélkül feltárt fermentlevet - adott esetben önmagukban ismert tisztítási műveletek után - valamely alkalmas makroretikuláris adszorbenssel vagy kationcserélő gyantával hozzuk érintkezésbe, majd az adszorbens illetőleg ioncserélő felületén megkötött korrinoidokat cianid-ionokat tartalmazó vagy ilyeneket leadni képes vizes oldatnak a korrinoidokra számítva 1,1-2,0-szeres feleslegben levő cianid-iont szolgáltató mennyiségével hozzuk érintkezésbe, azután az adszorbenst illetőleg ioncserélőt vízzel mossuk és a képződött ciano-korrinoidokat ismert módon, célszerűen vizes etanollal leoldjuk. Az eljárás igen előnyösen alkalmazható hővel, cianid ionok nélkül feltárt fermentlevek esetében is, oly módon, hogy a szüretien fermentléből a korrinoidokat közvetlenül megkötjük makroretikuláris adszorpciós gyantán, mozgóágyas technológiával 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
