192162. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 47934 jelű antibiotikum előállítására
1 192 162 2 1. példa A Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 ferdeagar tenyészetére a következő táptalajt használjuk : alkotórész mennyiség (g/1) paradicsompép 20,0 főtt zabliszt 20,0 agar 20,0 deinonizált vízzel 1 literre kiegészítve. A fenti alkotórészek összekeverése után a táptalaj kémhatása pH 5,0, amit sterilizálás előtt 5n vizes nátriumhidroxid oldattal pH 6,7-re állítunk. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,5. A Streptomyces toyocaensis NRRL 15 009 spórákat ráoltjuk a fenti összetételű ferde-agarra és a beoltott agart 10 napon keresztül inkubáljuk 30 ”C hőmérsékleten. A tenyészet liofilizátumát a ferdeagarról készítjük és ezt használjuk a következő összetételű inokulum táptalaj beoltásához: alkotórész mennyiség (g/1) glükóz 15,0 ourgonya dextrin 20,0 szójapor 15,0 élesztőkivonat 1,0 kukoricalekvár 10,0 CaCO, 2,0 Hideg csapvízzel 1 literre töltjük fel. A fenti alkotórészek összekeverése után a tápta laj kémhatása pH 5,6, amit sterilizálás előtt 5n vizes nátriumhidroxid oldattal pH 6,5-re állítunk. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,5-^5,7. Az 50 ml inokulum tenyészeteket 250 ml-es, szélesszájú Erlenmeyer lombikokban inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten 48 órán keresztül, percenként 250-es fordulatszámú, 5 cm kitérésű forgómozgású rázógépen. Ezt az inkubált tenyészetet vagy kis térfogatú fermentorok beoltásához (az inokulum a fermentlé térfogatának 1 %-a) vagy a nagy térfogatú tenyészetek készítésénél alkalmazott két-lépéses inokulum táptalajának beoltására használjuk. Az antibiotikumot termelő A 47 934.1 fermentációs tenyészetet az alábbiak szerint készítjük. 800 ml kitenyésztett kétlépéses inokulumot használunk 100 liter alábbi összetételű steril fermentációs táptalaj beoltásához: alkotórész mennyiség (g/1) habzásgátló (Down Corning An-0,2 tifoam „A") glükóz 25,0 burgonya dextrin 30,0 melasz 3,0 szójapor 15,0 savhidrolizált kazein 1,0 CaCO, 2,5 Hideg csapvízzel 100 liter térfogatra töltjük fel. A fenti alkotórészek összekeverése után a táptalaj kémhatása pH 6,5, amit sterilizálás előtt pH 7,5-re állítunk be, 5n vizes nátriumhidroxid oldattal. Sterilizálás után a táptalaj kémhatása pH 6,9. A beoltott fermentációs táptalajt 165 literes fermentorban inkubáljuk 30 *C hőmérsékleten 4-4,75 napon keresztül. A fermentációs levet térfogatának egynegyedével azonos mennyiségű steril levegő percenkénti átvezetésével levegőztetjük és egy szokásosan használt keverővei kevertetjük 200-250 percenkénti fordulatszámmal. 2. példa A 2. példában az A 47 934 jelű antibiotikum izolálását illusztráljuk. 141 liter fermentlé kémhatását pH 10,5-re állítjuk 5n vizes nátriumhidroxid oldattal, 3% szűrést elősegítő adalékanyagot (Hyflo Super-cel, diatómaföld, Johns-Manville Corp.) adunk hozzá, és egy órán keresztül kevertetjük. A keveréket présszűrőn szüljük, 106 liter antibiotikumot tartalmazó tiszta szűrletet nyerve. A szűrlet kémhatását pH 7,0-re állítjuk 5n vizes nátriumhidroxid oldattal, és 10,6 liter Diaion HP-20 gyantát (nagy porozitású sztirol-divinilbenzol gyöngy kopolimer, Mitsubishi Shemical Industries Ltd., Tokio, Japán) adunk hozzá. A keveréket 60 percen keresztül kevertetjük, és a vizes fázist ieszívatással vagy szűréssel választjuk el a gyantától. Az antibiotikumot adszorbeált gyantát 30 liter vízzel mossuk egymás utáni adagokban adva a vizet a gyantára, majd kétszer 30 liter víz-metanol 4 : 1 arányú keverékével, minden egyes mosásnál 30 percen keresztül kevertetve, majd szűrve a gyantát. Az antibiotikumnak a gyantáról történő leoldásához a mosott gyantát 30 percen keresztül 30 liter metanol-víz 1 : 1 arányú keverékében kevertetjük, szűrjük és ugyanezt az eljárást mégegyszer megismételjük. Az 1 : 1 arányú metanol-víz szűrletet egyesítjük, csökkentett nyomású térben 4-5 literes térfogatra koncentráljuk (6-12% szilárd anyagot tartalmaz) és liofilizáljuk. így 79,1 g halványbarna színű por formájában jutunk a nyers, kb. 30-40%-os tisztaságú A 47 934 jelű antibiotikumhoz. Körülbelül 44-49%-os összkinyerést érünk el. 3. példa A 3. példában a savas lecsapással történő nyers A 47 934 jelű antibiotikum kinyerést mutatjuk be. Az A 47 934 jelű antibiotikum micélimból történő kiextrahálásához 450 ml fermentlé kémhatását pH 10,5-re állítjuk be és az oldatot szűrjük. A 47 934 jelű antibiotikumot tartalmazó szűrletet 200 milliliteres adagokra osztjuk és mindegyik kémhatását pH 2,5-re állítjuk 5n sósavval, hogy maximális lecsapást érjünk el. A csapadékot centrifugálással elválasztjuk, vízzel mossuk és ismételten centrifugáljuk. Az egyik adag csapadékot vízben szuszpendáljuk és fagyasztva szárítva 186 mg vízben oldhatatlan, 20%-os hatóanyagtartalmú, nyers A 47 934 jelű antibiotikumot nyerünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
