192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 téré vonatkozóan analitikai HPLC eljárással elemzőnk, az előző példákban leírtak szerint. A G faktorban dús 54—74. frakciót egyesítjük két hasonló tisztítási művelet: frakcióival és oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött, vízzel előzetesen kiegyensúlyozott 100 ml Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk 10 ml/ lm in sebességgel Az oszlopot hangyasavval pH 2,5-re beállított vízzel (300 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 0,75 liter víz/acetonitril (6:4) eleggyel hajtjuk végre. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizálva 960 mg G faktort kapunk. Az A4] 030 antibiotikum G faktor fehér szilárd anyag, melynek megközelítő elemi analízise a következő: 50,02% szén, 4,61% hidrogén, 4,74% klór, 6,11% nitrogén és 30,70% oxigén. 66%-os vizes dimetil-formamid-oMatbán a G faktor elektrometrikus titrálása két titrálható csoport jelenlétét jelzi pKa 5,4, illetve 7,0 értékkel, valamint további lehetséges pKa értéket 10,5 felett (kezdeti pH 6,32). Gyors atom-bombázást alkalmazó tömegspektrometriával körülbelül 1684-as molekulatömeget kapunk. Az A41030 antibiotikum G faktor KBr pasztillában felvett infravörös abszorpciós spektrumát a kísérő rajzok közül a 7. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós csúcsok figyelhetők meg: 3320 (nagyon széles, erős), 2975 (hegyes, gyenge), 2920 (hegyes, gyenge), 1659 (normális, erős), 1594 (széles, erős), 1512 (hegyes, erős), 1492 („váll1’), 1430 (hegyes, gyenge), 1386 (széles, gyenge), 1337 (széles, gyenge), 1308 (hegyes, gyenge), 1264 (hegyes, gyenge), 1230 (széles, közepes), 1145 (széles, közepes), 1077 (hegyes, közepes), 1062 (hegyes, közepes), 1014 (hegyes, közepes), és 846 (széles, közepes) cm'1. Az A41030 G faktor ultraibolya abszorpciós spektrumát semleges, savas és bázikus metanol/víz (1:1) elegyben a fenti 5. táblázat tartalmazza. Az A41030 antibiotikum G faktor ugyanazokban az oldószerekben oldódik, mint az A faktor. Az A41030 komplex A, B, C, D, E ,F és G faktorai szüikagél-vékonyrétegkromatográfía (TLC) és papírkromatográfia segítségével szeparálhatók és egymástól megkülönböztethetők. A bioautográfiához Bacillus subtilis organizmust használunk, AlZ elmozdulás arányát (Rx), melyet az A41030 A faktor 1,00 értékkel jelölt elmozdulásához viszonyítva fejezünk ki, a 6. táblázatban közöljük. 6. táblázat Rx Faktor Oldószerrendszer A B A 1,00 1,00 B 0,76 0,75 C 0,68 0,44 D 0,65 0,91 E 0,49 0,63 F 0,21 0,25 G 0.21 0,25 2 A rendszer Papír: Whatman No. 1. (kezeletlen). Oldószer: n-Butanol, víz/metanol (1:1.) eleggyel telítve. B rendszer Adszorbens: Meick-Darmstadt-Silica Gél 60. Oldószer: Acetonitril/etanol/víz (8:1:1,5). Az A 41030 A—G faktorainak retenciós időit nagy teljesítményű folyadékkromatográfiánál (HPLC) 10 mikronos LiChrosorb RP-18-cal megtöltött rozsdamentes acéloszlopot használva határozzuk meg foszforsavval pH 2,5-re beállított víz/acetonitril/dibutü-amin (82:18.0,03M) oldószerrendszert alkalmazva. Az oldószer átfolyási sebessége 0,75 ml/min. Az eluátumot 225 nm-nél az UV Abszorpció útján ellenőrizzük. A relatív retenciós értékeket, melyeket mindegyik faktornál az illető faktor és az A41030 A faktor retenciós idejének az aránya ad meg, a 7. táblázatban közöljük. 7.táblázat Relatív Faktor cm min Retenció A 6,4 19,2 1,00 B 4,1 12,3 0,64 C 5,4 16,2 0,84 D 3,8 11,4 0,59 E 2,7 8,1 0,42 F 4,5 13,5 0,70 G 4,5 13,5 0,70 Mivel az A41030 antibiotikum több faktora amfőtér, minthogy mind aminocsoportot, mind karboxil-funkciót tartalmaznak, alkalmas savakkal és bázisokkal sókat tudnak alkotni. Az A41030 antibiotikum komplex és faktorai hatásosak Gram+ mikroorganizmusokkal szemben, beleértve a Staphylococcus és a Streptococcus fajtákat. Ezen antibiotikumok hatásosan mozdítják elő szárnyasok, sertés és marha növekedését és megjavítják táplálékhasznosításukat. Az A41030 komplex és egyedi faktorainak aktivitását számos, alább leírt próbával mutatjuk ki. 10. példa Mintakészítés biológiai próbához és az A41030 A faktor mennyiségi elemzése szárított teljes fermentlében Egy liter teljes fertmentfolyadékot 200 ml térfogatra bepárolva és liofilizálva 31,5 g szárított teljes fermentfolyadékot kapunk. A szárított teljes fermentfolyadék 400 mg-os mintáját 3 x 10 ml vízzel (pH 8,5) extraháljuk. A kivonatokat egyesítjük, 10 ml térfogatra bepároljuk és e koncentrátum részleteit használjuk biológiai próbához. A turbidimetriás próbát félautomata rendszerben hajtjuk végre (Autoturb® microbiological assay system, Elanco) N.R. Kuzel és F. W. Kawanaugh leírása szerint (J. Pharmaceut. Sei. 60/5, 764 és 767 /1971/). Az A41030 komplexet vizsgálva a következő vizsgálati paramétereket alkalmazzuk: Staphylococcus aureus ATCC 192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
