192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 192.129 9144 7 pH-jú táplevesben, 4 óráig 37 °C-on inkubálva. A teszt mintákat és a standardot metanol/viz (1:1) elegyben oldjuk. A standardként szolgáló A41030 A faktort az Autoturbu készülék körfolyamú mintaszállító tartórészébe helyezzük 0,4, 0,6, 0,9,1,2 és 1,5 mcg/ml koncentrációkban. A fenti koncentrátum 1 ml-ét a következő eljárással tisztítjuk HPLC-vel történő analízis számára. (a) Egy C-18 SEP-PAK® „patront” (szűrőbetét) (Silica gel cartridge, Water Associates, Inc., Milford, Mass.) 10 ml metanollal mosunk, Luer-„fitting”-gel ellátott 10 ml-es fecskendőt használva, a szakterületen ismert módon. (b) A szűrőbetétet 10 ml vízzel mossuk.. (c) A fenti koncentrátum 1 ml-ét átbocsátjuk a szűrőbetéten körülbelül 1 ml/min sebességgel. 5 (d) A szűrőbetétet 1 ml vízzel mossuk és a szűrőbetétet száradásig átfúvatjuk. (e) A szűrőbetétet 1 ml tetrahidrofurán/víz 1:1 eleggyel eluáljuk körülbelül 0,5 ml/min sebességgel. (f) Az eluátumból a tetraíüdrofuránt vákuumban, 1 o va£y pedig nitrogéngáz alatt eltávolítjuk és az eluátum térfogatát vízzel újra 1 ml-re kiegészítjük. (g) Az oldatot HPLC eljárással elemezzük, a már leírtak szerint. A száraz teljes fermentfolyadék biológiai aktivitás-próbájának és HPLC elemzésének eredményeit a 8. f 5 táblázat tartalmazza. 8. táblázat A41030 A biológiai aktivitása és HPLC analízise teljes fermentfolyadékban Minta száma Tömeg A41030 A koncentr.* * Aktivitás össztömeg* A41030 A össztömeg A41030 A %-a* 1. 106,8 kg 4,42 mg/g 491 g 472 g 96,1 2. 146,5 kg 10,8_ mg/g 1.685 g. 1.582 g 93,9 * Az A41030 A, B, C, D, E, F és G faktorból származó teljes biológiai aktivitás * HPLC-vel meghatározva 35 Agar-hígításos próba Az „International Collaborative Study Group” (ICS) által leírt agaT-hígításos eljárást használjuk a 4 J MIC-értékek (legkisebb gátló koncentrációk) meghatározására. Az A41030 antibiotikum A faktorral végzett agar-hígításos próbák eredményeit a 9. táblázat tartalmazza: 45 9. táblázat A41030 A faktor aktivitása Kísérleti organizmus Mg/ml 50 Staphylococcus aureus 3055* < 0,5 Staphylococcus aureus 3074** < 0,5 Streptococcus faecalis X66 ___________<0,5 *benzilpenicillin-érzékeny 55 **benzilpenicillin-rezisztens Korong-módszerrel meghatározott érzékenység Kísérleti organizmusokkal beoltott agar-lemezeket használunk, 6 mm-es korongokat (0,02 ml fel- 60 vevőképesség) az antibiotikumoldat 2-es alapú logaritmikus hígításaiból telítünk. A korong antibiotikumtartalma a használt oldat koncentrációjának 1/5-c vagy 1/50-e, azaz 100 mg vagy 10 mg antibiotikumot tartalmazó korongot kapunk 500 mg/ml koncentrációjú oldatból. Az A41030 antibiotikum A faktor által létrehozott gátlási zónák méretét a 100 és 10 pg antibiotikumot tartalmazó korongok alkalmazásakor a 10. táblázat tartalmazza. 10. táblázat Az A41030 A faktor aktivitása Zóna-átmérő (mm) Hg/korong Kísérleti organizmus 100 10 Staphylococcus aureus 3055* 20,8 17,2 Staphylococcus aureus 3074** 19,8 16,7 Staphylococcus aureus 3130*** 21,4 17,4 Streptococcus pyogenes C203 15,0 12,0 Streptococcus sp.(D csoport) 9960 20,5 16,4 Streptococcus pneumoniae Park I 17,0 15,0 Escherichia coli EC 14 __?LQ_ 0 14
