192129. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A-41030 jelzésű antibiotikumok előállítására
1 2 oldószerrendszerrel eluáljuk és 480 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluátumot „ISCO Model UA-5” UV detektorral ellenőrizzük 254 nm hullámhosszon. Egyes frakciókat az F faktor jelenlétére nézve elemzünk analitikai HPLPLC-vel, laboratóriumunkban 25-40 mikronos LiChroprep RP-8-cal megtöltött, 0,8 x 30 cm méretű „Micnel-Miller” üveglapon. A víz/acetonitril/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószert „FMI” szivattyúval adagoljuk 4 ml/min sebességgel. Az F faktort „ISCO Model UA-5” UV detektorral mutatjuk ki 254 nm-nél. Az 1-25. frakciókat elöntjük. Az F faktorban dús 26—36. frakciót egyesítjük és csökkentett nyomáson körülbelül 500 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük, átszűrjük és a szűrletet oszlopban (2,8 x x 22 cm) levő, előzetesen vízzel egyensúlyba hozott 100 ml Diaion HP-20 gyantára visszük fel, 10 ml/min sebességgel. Az oszlopot vízzel (900 ml) mossuk, amíg a mosó folyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 1 liter víz/ /acetonitril (6:4) eleggyel hajtjuk végre 15 ml/min sebességgel. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizáiva 2,6 g részlegesen megtisztított F faktort kapunk. E készítmény 500 mg-ját feloldjuk 10 ml víz/acetonitril/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószerben, a pH-t vizes nátrium-hidroxid-oldattal 7,0-ra állítva be. Az oldatot laboratóriumunkban 25—40 mikronos LiChroprep RP-18-cal megtöltött, 4,7 x x 45 cm-es „Michel-Miller” üveg-oszlopra visszük fel. Az oszlop eluálását 6 ml/min sebességgel „FMI” szivattyút alkalmazva hajtjuk végre, a minta feloldására használt oldószerrendszerrel és 24 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az eluátumot „ISCO Model UA-5” UV detektorral 254 nm-nél ellenőrizzük. Egyes frakciókat az F faktor jelenlétére nézve elemzünk, a fentebb leírt analitikai HPLPLC rendszert használva. Az eluátum F faktorban dús 194—2520 ml-es részét csökkentett nyomáson mintegy 300 ml-re bepároljuk. Két hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük és oszlopba (2,8 x 22 cm) töltött, vízzel előzőleg kiegyensúlyozott 100 ml Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk át 10 ml/min sebességgel, Az oszlopot hangyasawal pH 2,5-re beállított vízzel (300 ml) mossuk, amíg a mosófolyadékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem mutatható ki. Az eluációt 0,75 liter víz/acetonitril (6:4) eleggyel hajtjuk végre. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepárolva és liofilizáiva 299 mg F faktort kapunk. Az A41030 antibiotikum F faktor fehér szilárd anyag, melynek megközelítő elemi analízise a következő: 51,39% szén, 3,96% hidrogén, 6,45% klór, 6,45% nitrogén és 28,65% oxigén. 66%-os vizes dimetil-formamid-oldatban az F faktor elektrometrikus titrálása két titrálható csoport jelenlétét jelzi körülbelül 5,4, illetve 7,1 pKa értékkel, lehetséges további pKa értékekkel 10 felett (kezdeti pH 5,93). Gyors atom-bombázást alkalmazó tömegspektrometriával körülbelül 1555-ös molekulasúlyt kapunk. Kísérletesen az F faktornak a C7oH64Cl3N702g tapasztalati képletet tulajdonítjuk. A molekulasúlyra vonatkozó adatok arra engednek következtetni, hogy az F faktort az A faktortól két cukorrész hozzáadódása különbözteti meg és a páratlan számú molekulatömeg arra utal, hogy aminocukor nincs jelen. Az A41030 antibiotikum F faktor KBr tablettában felvett infravörös abszorpciós spektrumát á mellékelt rajzok közül a 6. ábra mutatja. A következő megkülönböztethető abszorpciós csúcsok figyelhetők meg 3448-3226 (erős, széles), 1653 (erős), 1600 (közepes), 1504 (érős), 1429 (gyenge), 1258 (gyenge), 1227 (erős), 1136 (erős), 1075 (erős), 1053 (erős) és 1010 (erős) cm'1. Az A41030 F faktor ultraibolya abszorpciós maximumait semleges, savas és lúgos metanol/víz elegyben (1:1) a fenti 5. táblázat mutatja. Az A41030 antibiotikum F faktor ugyanazokban az oldószerekben oldódik, mint az A faktor. A megfigyelt fizikai-kémiai adatok alapján az A41030 F faktornak az (V)képletű szerkezetet tulajdonítjuk. 9. példa A41030 G faktor izolálása Az A41030 komplex 8 g-ját (a 2. példa szerint előállítva) 200 ml víz/acetonitril/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószerben oldjuk és átszűrjük. A szűrletet rozsdamentes acéloszlopra (8 x 100 cm) visszük fel, melyet laboratóriumunkban a 3. példában leírt speciális eljárással előállított, 10—20 mikronos LP-l/C] 8 fordított fázisú szilikagél 4 literével töltöttünk meg. Az oszlop egy „Chromatospae Prep-100” egység része (lásd a 3. példát). Az oszlopot 60 ml/min sebességgel víz/acetonitril/NaCl (84:16:2 g per liter) oldószerrel eluáljuk, 480 ml-es frakciókat gyűjtve. Egyes frakciókat a G faktor jelenlétére nézve elemzünk analitikai nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével, az előző példákban leírtak szerint. A fordított fázisú szilikagél-oszlop eluátumát 254 nm-nél ellenőrizzük a 3. példában leírtak szerint. A G faktorban dús 22—35. frakciót egyesítjük, és csökkentett nyomáson 500 ml térfogatra bepároljuk. Három hasonló tisztítási művelet koncentrátumát egyesítjük, a pH-t vizes nátrium-hidroxid-oldattal 8,5-re állítjuk be és átszűrjük, A szűrletet 10 ml/min sebességgel oszlopban (2,8 x 22 cm) levő, vízzel előzőleg egyensúlyba hozlott 100 ml Diaion HP-20 gyantán bocsátjuk át. Az oszlopot hangyasavval pH 2,5-re beállított vízzel (400 ml) mossuk, amíg a mosófolyaiékban kicsapással kloridion (mint AgCl) már nem nutatható ki. Az eluációt víz/acetonitril (6:4) elegygyel hajtjuk végre 15 ml/min sebességgel, 1 literes frakciókat gyűjtve. A frakciókat B. subtilis elleni aktivitásra nézve elemezzük. Az aktív frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk, majd liofilizáljuk. 2,85 g anyagot kapunk. Ezen anyag 0,5 g-ját 10 ml víz/acetonitril/dibutil-amin (80:20:0,03M, foszforsavval pH 7,8-ra beállítva) oldószerelegyben oldjuk, az oldódás elősegítésére dibutil-amint alkalmazunk (végső pH 8,2). Az oldatot 2,8 x 59 cm méretű „Michel-Miller” HPLPLC üvegoszlopra visszük fel, melyet 25-40 mikronos LiChroprep RP-8-cal töltöttünk meg (MC/B Manufacturing Chemist, Inc., Cincinnati, OH), „FMI” szivattyút használva az oszlopot 4 ml/min sebességgel eluáljuk a minta feloldására használt oldószerrendszerreí. Az eluátumot „ISCO Model UA—5” UV detektor segítségével ellenőrizzük 254 nm-nél. Egyes 10 ml-es frakciókat a G faktor jelenlé-192.129 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
