192123. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon indukálására
1 2 interferon indukálására, amely a szervezetben az interferon termelését magas titerrel és in vitro tenyésztett sejtek magas interferon termelését biztosítj»A kitűzött célt az (I) általános képletű 2,6-bisz-(dietanol-amino)4,8-dipiperidin-pirimid-[5,4-b]-pirimidin (dipiridamol) használatával értük el. ✓ A dipiridamol ismert vegyület, koronaér-tágitó és véralvadásgátló hatóanyagként használják, ismeretes továbbá egyes, DMS- és RNS-tartalmú vírusokkal szemben in vitro kísérletekben mutatott vírusellenes hatása. A dipiridamol interferon-indukáló hatását in vitro kísérletekben többek között emberi és egér lifoid (explantált, sejtvonalak) és nem lifoid sejtek tenyészetén, in vivo kísérletekben pedig fehéregereken és emberen vizsgáltuk. A dipiridamol interferon-indukáló hatásának in " vitro vizsgálatára két módszert használtunk. Lackovic és munkatársai által leírt módon explantált peritoneális egér-leukociták limfoid sejtjeinek szuszpenziós tenyészetét készítettük (2,5.106 sejt/ml-tápközeg, 199 tápközeg ♦ 10% inaktivált boíjúszérum), elvhez hozzáadtuk közvetlenül a készítés után a dipiridamol t, 20 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk, és a kialakult egyrétegű sejttenyészetből (L-sejtek, embrionális egér-fibroblasztok, diploid embrionális emberi tüdő•fibroblasztok) próbákat vettünk az interferon titrálása érdekében. Ekkor “áz interferon titrálásával egyidőben meghatároztuk az antivírus-ellenállóképességet. A sejteket (előnyösen a hosszabb ideig — 96 óra - tenyésztetteket) 4 óra hosszat 37 °C-on dipiridamollal kezeltük (199 tápközeg + 10% inaktivált boíjúszérum), majd kétszer öblítettük, és friss, dipiridamolt nem tartalmazó tápközeget adtunk hozzá (199 tápközeg * 2% inaktivált boíjúszérum), és a tenyészetet 23 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk. A citotoxicitás mikroszkopikus megállapítása után a tápközeget összegűjtöttük, és az , interferontartalmatmeghatároztuk. A sejteket Hanks-sóoldattal öblítettük, és 100 TCIDjo vesikularis stomatitis vírussal (Indiana törzs) beoltottuk, 48 óra hosszat 37 °C-on inkubáltuk, ezután meghatároztuk a citopatologikus hatást és a fertőző vírus-hozamot (és ezen az alapon az antivírus-eUenállóképességet). Az interferon-indukáló hatás meghatározása érdekében in vivo kísérletekben dipiridamolt adagoltunk nőstény 20-25 g testsúlyú fehéregereknek különböző módon: intravénásán, interperitoneálisan vagy perorálisan. Az interferon-titer megállapítására szérumpróbákat vettünk a 6., 12., 24., 48., 72. és 96. órában (8 állatból gyűjtött szérumminták). Kontrollként olyan csoportot használtunk, amelyben az állatok nem kaptak dipiridamolt. A vegyület akut toxicitását a különböző adagolási módokban (LD50) előre meghatároztuk. Embereken az Interferon-titert önként jelentkezőkön közvetlenül a dipiridamol bevétele előtt határoztuk meg. 100 mg dipiridamol egyszeri perorális alkalmazása után szérumpróbát vettünk 24 óra és 48 óra múlva az interferon-titer individuális meghatározására. Az interferon-titert a következő módszerrel határoztuk meg: a) plakk-inhibiciós eljárás L-sejtekben vagy emberi embrionális diploid fibroblasztokban vezikuláris stomatitis vírusban (Indiana törzs) egy vírus detektorra, b) ugyanazon vírus citopatikus hatásának gátlása (emberi embrionális diploid fibroblasztok felhasználásával). NE/ml egységekben fejezzük ki egér vagy emberi interferon vonatkoztatási preparátumhoz viszonyítva. A dipiridamol által indukált interferon azonosítását egy sor teszttel végeztük: ellenpróba a viricid hatás hiányára, egy antivirus specifikus tulajdonság hiányára vonatkozó teszt, faj-specifitásra vonatkozó tészt, hővei szembeni ellenállóképességre vonatkozó teszt (30—60 perc, 56 °C, 565 °C, 75 °C), tripszin•érzékenység, ribonukleázokkal és dezoxiribonukleázokkal szembeni érzékenység, interferon semlegesítésére vonatkozó teszt egy antiinterferon-szérum és 1,2 és 4 NE vizsgált és egy referencia interferon felhasználásával. Az interferon induktorként használt dipiridamol antivírusos hatását in vivo kísérletekben kísérleti fertőzésekkel igazoltuk, Sernilki-vírus, Herpes Simplex I típusú vírus és Grippe A virus használatával fehéregereken (10-12 g). Az első két vírus esetén (Semilki és Herpes Simplex I) 10 LD50 vírust vittünk be. A dipiridamolt egyszer alkalmaztuk intraperitoneálisan vagy orálisan (a vírusfertőzés előtt 24 órával, utána 24 vagy 72 órával). A letalitás kumulatív folyamatának dinamikáját (alfavírus-szerű vagy herpes vírus-szerű enkefalitis) kontrollal (placebo) való összehasonlításban állapítottuk meg. A dipiridamol limfoid sejtekben kifejezett interferon indukáló aktivitást mutat. Egér peritoneális leukocitákban az optimális interferon indukáló koncentráció (100 jumól/1) hatására az indukált interferon 256 NE/ml maximális titert ér el. A dipiridamol egér vagy humán nem-limfoid sejtek tenyészetében is indukál interferont (humán embrionális diploid fibroblasztok, egér embrionális fibroblasztok, L-sejtek), melynek során az L-sejtekben indukált interferon titere eléri a 128 NE/ml-t. Az 1. táblázatban összefoglaltuk a dipiridamol in vitro interferon indukáló aktivitására vonatkozó adatokat a kvantitatív fő paraméterekre — minimális Interferon indukáló koncentráció (min. IFN-IC), optimális interferon indukáló koncentráció (opt. IFN-IC) és az opt. IFN-IC-vel indukált interferon maximális titere — vonatkozóan. Hangsúlyozandó a dipiridamol•hatás megfelelő szelektivitása: a sejtek által maximálisan elviselhető koncentráció és a peritoneális egér leukociták min. IFN-IC értéke közötti arány 100 fölött van, az L-sejtek esetén 30 fölött, és a humán diploid fibroblasztok esetén 30 fölött. A dipiridamol in vivo erős interferon indukáló hatást mutat. A vegyület fehéregerek esetén különösen hatásos, ha 3,12-100 mg/kg dózisban orálisan adagol-192.123 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
