191987. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfortartalmú amidvegyületek előállítására
33 191987 34 savai eluáltuk. Az eluátumot 7 ml-es frakci ókba szedtük! mindegyiknek meghatároztuk az enkefalin-inaktiváló hatását. A fenti körülmények között az enkefulináz A—aktivitást a 120 és 200 ml közötti eluátumban találtuk, ezután következett az aminopeptidáz-aktivitás (260-400 ml), végül az enkefalináz B-aktivitás (420-450 ml). Az enkefalint inaktiváló hatást, radiometrikus vizsgálattal mutattuk ki. A szubsztrátum 3H-Met5-enkefalin (50,1 Ci/mmól, New England Nuclear), 7,4 pH-èrtékü 0,05 M trisz-pufferral hígitva, úgy hogy a reakciókeverék végső koncentrációja 40 nM volt. Az enzimet és a szubsztrátumot tartalmazó teljes reakciókeverék térfogata 250 pl volt. Az inkubalást 37 °C 90 percig végeztük. A reakció leállítása céljából a csöveket 15 percre forrásban lévő vízfürdőbe helyeztük. A kapott termékeket vékonyréteg-kromatográfiával választottuk el egymástól. A reakciókeverék 4 pl-es részleteit cseppentettük fel 20x20 crn-es Baker-flex Silica Gel IB lemezekre, jelzetlen standardokkal (Met5-enkefalin, tirozin, Lirozil-glicin, tirozil-glicil-glicin) együtt és ezeket együtt kromatograf éltük izopropanol-etilacetát- 5%-os ecetsav 2:2:1 arányú oldószerrendszerben, amely a 9 Met5-enkefalint a bomlástermékeitől el tudja különíteni. A teljes futtatási idő körülbelül 17 óra volt. A futtatás megkezdése előtt a vékonyréteg-kromatográfiás kádakba nitrogéngázt vezettünk. A futtatás befejezése 10 után a foltokat a ninhídrín-permetezéssel tettük láthatóvá. Ezeket a foltokat a lemezeken a körülöttük lévő részekkel együtt a lemezekről leválasztottuk, és az egyes foltoknak megfelelő radioaktivitást folyadék-szcin- 15 tillációs számlálással mértük. Az IC50 meghatározását lineáris regressziós eljárással végeztük. Ezt az eljárást alkalmazva azt találtuk, hogy például a választott vegyületek alábbi 20 nanomoláris (nM) koncentrációit használva, ahol az enkefalináz A hatását 50%-kal gátolják (IC50). Az eredményeket az ,A‘ táblázat szemlélteti. „A" táblázat Az alkalmazott vegyület a (XXXV) általános képletü vegyület Enkefalináz gátlás * A Y Z R2 IC50 nM s-H-CONli-(Cliz)2--011 19.0 s-Cl-CONH-(CHz)2--OH 11.0 R,S-CsHs-CONH-(CH2>2--OH 1.3 s-H-CONH— ( C H 2 ) 2—-OC2H5 60 s-H-CONH-(CH2)2--0(CH2)20C«H5 210 s-H-CONH-(CH2)3--OH 80 s-H-CONH-CH2CH(CH)3-OH 25.5 R-H-CONH— ( C H 2 ) 2—-OH 600 R,S-CF3-CONH— ( C H 2 ) 2—-OH 60 R,S-CF3-CONH-(CH2)2--OC2H5 2.200 S-H-CONHP-C6H4-**-OC2H5 63 R,S-H-HNCOO-CH(CH3)***-OH 100 S-H-CONH--CH2C1MOH)-OH 25 * sztereokémiái megjelölés (R,S vagy R,S) ** R,S szetereokémiai forma *** R sztereokémiái forma Azt, hogy az említett vegyületek a (D-Ala^Met5) enkefalin-amid fájdalomcsillapító 55 hatását potenciálják, a következő eljárással állapítottuk meg. Eljárásunk alapját Chipkin, R. E., lorio, L. C., Barnett, A., Bergei-, J. és Billard, W. módszere képezte: Regulatory Peptides: From Molecular Biology to Function, 60 E. Costa és M. Trabucchi kiadása, Raven Press, New York, 1982, 235-242. oldal 19-23 g-os him CF1 egereket használtunk (Charles River Breeding Labs. Mass.), N=10/dózis vagy dóziskombináció. Az egerek fai kán alkalmaztunk ingert, hasonlóan Dewey és Harris módszeréhez [Methods in Narcotic Research, S, Ehrenpreis és A. Neidle kiadása, 101-109. oldal, Marcél Dekker, Inc. New York, 1975], sugárzó hő káros ingert alkalmazva. A kontroll lappangás idő (tipikusan 2-3 mp) meghatározása után az egereknek bőr alá vagy szájon át beadtunk oldószert (vakpróba) vagy gyógyszert, majd megfelelő idő mú'va intracerebroveritrikulárisan beinjekcióztunk 10 pl sóoldatot vagy (D-Ala^Met5)-enkefalin-aniidot Haley és McCormick szerint 1B
