191865. lajstromszámú szabadalom • Eljárás LH-RH antagonista peptidek előállítására

1

191 865

II. táblázat folytatása

2

dehidro-Pro1, 4-F-D-Phe2, D-Trp3,6]-GnRH-t,

vagy pedig a vizsgálandó peptidet adjuk 0,01—10 nanomól koncentrációban. A csak GnRH-val kezelt mintákban szekretált LH mennyiségét összevetjük a pepiiddel plusz GnRH-val kezelt mintákban kiválasztott LH- mennyiséggel.

Kisebb, mint

0,l[antagonista]

l[GnRH]

arány mellett a standard peptid általában 50 %-át blokkolja a GnRH hatására felszabadult LH mennyiségének.

A fent leírt peptid nőstény patkányok ovulációjára gyakorolt gátló hatását is meghatározzuk. E próbában adott s?ámú (6 darab), 225-250 g testsúlyú ivarérett nőstény Sprague-Dawley patkányt beoltunk kukoricaolajban felvett 10 /Ug peptiddel, déltájban a proösztrusz napján. A proösztrusz az ösztrusz (ovuláció) előtti délutánra esik. Kontrollként külön nőstény patkánycsoportot használunk, melynek nem adunk peptidet. A kontroll nőstény patkányok mindegyikénél ovuláció következik be az ösztrusz idején; a kezelt patkányok egyikénél sem jön létre ovuláció. Így tehát a peptid nagyon hatásosan gátolja a nőstény patkányok ovulációját igen alacsony dózisokban, és a peptidet tökéletesen hatásosnak tartjuk körülbelül 10 /ag dózisban. További próbákat végzünk alacsonyabb dózisokkal, melyeknek eredményeit a II. táblázatban adjuk meg.

A fennmaradó 2—7. számú peptidet hasonlóan szintetizáljuk és tisztítjuk. Az aminosavelemzés elvégzése után a tisztaságot HPLC útján állapítjuk meg különböző oldószenenűszereket alkalmazva. A hasonló módon végrehajtott ln vitro próba azt mutatja, hogy az összehasonlító standard pepiidhez viszonyítva mindegyik vizsgált peptid hatásos, Az in vivo próbát különböző dózisokkal hajtjuk végre, Az eredményeket a II. táblázat tartalmazza.

II. táblázat

Peptid

száma

In vitro hatékonyság

In vivo

dózis (Mg) ovuiáló állatok sz.

í.

0,44

10

0/6

5

0/8

2,5

0/10

1

0/8

0,5

2/11

2.

1,4

5

3/6

3.

.1

0/10

0,56

0,5

2/10

4.

0,38

10

0/8

5

0/7

2,5

0/10

1

0/4

,

0,5

6/6

5.

0,20

5

4/10

6.

0,46

2,5

9/10

7.

0,63

1

1/10

0,5

7/10

8.

1

0/5

0,5

Pep'id In vitro In vivo

száma hatékonyság * dózis (pg) ovuiáló állatok sz.

9.

1

0/7

0,5

10.

1

0/4

11.

2

1/10

1

5/10

12.

1,5

6/7

13.

10

0/10

+ = [Ac-dehidro-Pro1,

4—F—D—Phe2,

D-Trp3^ j-GnRH-hoz viszonyítva.

Mindegyik vizsgált peptid alkalmas koncentrációban in vitre igen hatásosan gátolja a GnRH-indukált LH- szekréciót, bár legtöbbjük in vitro valamivel kevésbbé hatásos az összehasonlító standardnál; e peptidek azonban in vivo sokkal hatásosabbak.

Mindegyik peptid igen kis dózisokban hatásosan gátolja nőstény emlősök ovulációját, és némelyikük legalább kétszer hatásosabb bármely eddig ismert és vizsgált GnRH-antagonistánál.

A találmány szerinti peptideket alkalmazhatjuk gyógyszerészetileg elfogadható,' nem mérgező sók, mint savaddíciós sók, vagy fémkomplexek, például cinkkel, báriummal, kalciummal, magnéziummal, alumíniummal és hasonlókkal képezett sók (melyeket itt addíciós sóknak tekintünk), vagy a kettő kombinációjának formájában. Jellemző savaddíciós só a hidroklorid, hidrobiornid, szulfát, foszfát, nitrát, oxalát, fumarát, glükonát, tannát, maleát, acetát, citrát, benzoát, szukcinát, alginát, pamoát, malát, aszkorbát, tartarát és hasonlók. Ha a hatóanyagot tabletta formájában kívánjuk alkalmazni, a tabletta gyógyszeiészetileg elfogadható hígítót tartalmazhat, kötőanyaggal, mint tragakanttal, kukoricakeményítővel vagy zselatinnal; szétesést elősegítő szerrel, mint alginsavval; és síkosító anyaggal, mint magnézíumsztearáttal együtt. Ha folyékony formát akarunk alkalmazni, a gyógyszerészetileg elfogadható hígító részeként édedtő és/vagy ízesítő anyag használható. Intravénás adagoláshoz izotóniás sóoldatot, foszfát puffer oldatokat és has anlókat alkalmazhatunk.

A gyógyászati készítmények a peptidet általában szokványos, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt tartalmazzák. A dózis szokásosan mintegy 1 — 100 pg peptid per testsúly-kg intravénás kezelés esetén; az orális dózisok magasabbak. E peptidekkel a betegek kezelését általában ugyanúgy hajtjuk végre, mint a klinikai kezelést egyéb GnRH-antagonistákkal.

E peptidek emlősöknek intravénásán, szubkután, intiamuszkulárisan, orálisan, intranazálisan vagy intravaginálisan alkalmazhatók megtermékenyülés-gátlás és/ vagy -szabályozás céljából. Használhatók továbbá az ivarmii igyek működésének reverzibilis visszaszorítására, mint például korai pubertás esetén, vagy sugár- vagy kemoterápiás kezelés folyamán. A hatásos dózisok az alkalmazás módjától és a kezelt emlős fajtájától függnek. Jellemző dózisfonna például a fiziológiás konyhasóoldatban oldott peptid, melyet körülbelül 0,1-2,5 mg per testsúly-kg tartományban alkalmazunk. Orálisan a peptid szilárd vagy folyékony formában adható.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5