191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 A találmány szerinti eljárást olyan specifikus DNS- sel szemléltetjük, amelyet baktériumba helyezünk, és amely tartalmazza a patkány preproinzulinjának, a patkány növekedési hormonjának és az ember növekedési hormonjának génjeit. Ezzel bizonyítjuk, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmas bármely magasabbrendű szervezetből, például gerincesekből származó DNS bevitelére bármely mikroorganizmusba. Magasabbrendű szervezétek alatt értjük az eukariota szervezeteket, amelyeknek differenciált szöveteik vannak, például a rovarok, puhatestűek, növények, gerincesek, köztük az emlősök, mint például a szarvasmarhák, sertések, vagy maga az ember. Mikroorganizmusként használhatunk bármely mikroszkopikus élő szervezetet, mint például protozoát, prokariotát vagy eukariotát, mint például baktériumokat, protozoákat, algákat vagy gombákat, mint például élesztőket. A találmány szerinti eljárás során először továbbfejlesztett eljárással elkészítjük a kiválasztott sejttenyészetet. A sejtekből új eljárással sértetlen mRNS-t extrahálunk, miközben gyakorlatilag a teljes ribonukleáz aktivitást gátoljuk. A sértetlen mRNS-t oszlopkromatográfiával különítjük el az extraktumból, majd a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében a reverz transzkriptáz enzim hatásának tesszük ki, amiután megkapjuk a komplementer (cDNS) dezoxi-ribonukleinsav szálat. A reverz transzkriptáz enzimmel kivitelezett első reakció után a termékből szelcktíve eltávolítjuk a megfelelő ribonukleotid-szekvenciát tartalmazó részt. Az így kapott dezoxi-nukleotid-molekulát, amely az eredeti mRNS-val komplementer, a reverz transzkriptáz vagy a DNS- polimcráz és a négy dezoxi-nukleozid-trifoszfát jelenlétében inkubáljuk. Az így kapott vegyület egy kettős szálú cDNS molekula, amely az egyik végüknél egyszálú hurokkal összekapcsolt komplementer szálakból áll. Ezt a vegyületet ezután az egyszálú darabra specifikus nukleázzal reagáltatjuk, amely enzim lehasítja az egyszálú hurkot. A reakció után kapott Icétszálú cDNS-t ezután meghosszabbítjuk oly módon, hogy mindkét végéhez hozzákapcsolunk egy a restrikciós enzimre érzékeny bázis-szekvenciát tartalmazó specifikus DNS-t. Ezt a reakciót a DNS-ligáz enzim katalizálja. A meghosszabbított cDNS-t ezután a restrikciós> endonukleázzal kezeljük, amely mindegyik szál 5 -végén önmagára komplementer egyszá- Jü végeket tartalmazó kétszálú molekulát hoz létre. A plazmid DNS-t, amely ugyanarra a restrikciós cndonukledzra érzékeny bázis-szekvenciát tartalmaz, reagáltatjuk az enzimmel, amikor lehasad a polinukleotid-szál, és olyan molekulát kapunk, amely az 5 - végén önmagában komplementer egyszálú darabot tartalmaz. Ezután eltávolítjuk az egyszálú DNS darab 5 -terminális foszfát-csoportjait, abból a célból, hogy megakadályozzuk a plazmidot a gyűrűs szerkezet felvételében. Az előállított cDNS-t és a plazmid DNS-t a DNS- ligáz jelenlétében együtt inkubáljuk. A későbbiekben részletesen megadott reakciókörülmények között csak abban az esetben jön létre a plazmid DNS-ből előnyös tulajdonságú, két végén zárt gyűrű, ha a cDNS-bői egy darab beépül a molekulába. A cDNS- szekvenciát tartalmazó plazmidot ezután bejuttatjuk a megfelelő gazdasejtbe. Az életképes plazmidot befogadó sejteket úgy mutatjuk ki, hogy az ezekből a sejtekből kifejlődött telepek, a plazmid által meghatározott genetikai tulajdonsággal rendelkeznek, például rezisztensek bizonyos gyógyszerekre. A beépített cDNS darabot hordozó rekombináns plazmidot tartalmazó tiszta baktérium törzseket ezután tenyésztjük, majd újra izoláljuk a rekombináns plazmidot. Ily módon nagymennyiségű rekombinálódott plazmid DNS-t különíthetünk el, a specifikus cDNS darabot ebből a megfelelő restrikciós enzim endonukleotikus hatását kihasználva elkülöníthetjük. A találmány szerinti eljárás alaplépése bármely magasabbrendű szervezetből, például az emberből nyert nukleotid-szekvencia izolálása és bevitele egy mikroorganizmusba. A találmány szerinti eljárást felhasználhatjuk egy gyógyszerészeti vagy ipari értékű inzulin szintézisét meghatározó gén átvitelére, és ennek a proteinnek a mikrobiológiai szintézisére. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére a patkány inzulint kódoló nukleotid-darabot izoláltuk, baktériumokba juttattuk és ott replikáltuk. A találmány szerinti eljárás felhasználható az emberből izolált DNS átvitelére, így például az emberi inzulin átvitelére is. A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. A találmány során ismertetjük egy specifikus nukleotid-sorrendű DNS-molekula izolálásának módszerét, ennek átvitelét egy mikroorganizmusba, ahol a DNS eredeti nukleotid-sorrendje replikáció után újra kimutatható. A találmány szerinti eljárás lépéseit négy általánosan érvényes fejezetre oszthatjuk fel : 1. A kívánt sejttenyészet izolálása egy magasabbrendű szervezetből Egy adott fejérjét meghatározó genetikai bázis-sorrendnek két lehetséges forrása van: az organizmus saját DNS-e és a DNS-t másoló RNS. Az Egyesült Államok National Institutes of Health jelenleg érvényes biztonsági követelményei szerint bármely emberi gént csak abban az esetben helyezhetünk rekombinálódó DNS-be, majd ezután baktériumba, ha a géneket igen gondosan tisztítottuk, vagy a kísérleteket különleges, a nagy kockázatot figyelembe vevő (P4) körülmények között végezzük (erre vonatkozóan lásd Federal Register, 41. kötet, 131. szám, 1967. július 7., 27, 902-27 943. oldal). így bármely olyan eljárást, amelynek potenciális felhasználása emberi protein előállítása lehet, mint például a jelen leírás is, az előállítandó proteint kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó mRNS izolálásával kezdünk. Ennek a módszernek az a további előnye, hogy a mRNS sokkal könnyebben tisztítható, mint a sejtből extrahált DNS. Különösen előnyösen használható fel az a tény, hogy a magasabbrendű szervezetekben, mint például a gerincesekben meghatározhatjuk a szervezeten belül azon sejtek elhelyezkedését, amelyek működése a kérdéses protein termeléséhez vezet. Előfordulhat, hogy ez a sejttenyészet az organizmus átmeneti fejlődési stádiumainak egyikében létezik. Ezekből a sejtekből izolált nagymennyiségű mRNS tartalmazza a kívánt nukleotidszekvenciát Az izolált mRNS tisztasága szempontjából lényeges az izolált sejtpopuláció kiválasztása és az izolálás módja. Legtöbb szövetbe, mirigyben vagy szervben a sejteket fibrózus szövetháló tartja össze, amely 803 5 i0 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 5
