191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 főképpen kollagénből áll, de a szövettől függően más szerkezeti proteineket, poliszaharidokat és ásványi anyagokat is tartalmazhat. Egy adott szövetből sejteket izolálva fel kell használnunk azokat az eljárásokat, amelyek lehetővé teszik a sejtek felszabadítását a környező szöveti anyagból. Egy specifikusan differenciálódott sejttípus izolálása és tisztítása két fő lépésből áll: a sejtek elkülönítése a környező szöveti anyagból, továbbá a sejtek elkülönítése a szövetben lévő összes más típusú sejtből. A találmány szerinti eljárás során ismertetett alapelveket felhasználhatjuk egy sor más szövet sejtjeinek izolálására is. Részletesen ismertetjük a hasnyálmirigy Langerhans-szigeteinek izolálását, amelyek az inzulint kódoló mRNS izolálására használhatók fel. Az inzulint termelő sejteket elkülöníthetjük más forrásokból is, például borjú-hasnyálmirigyből vagy tenyésztett Langerhans tumorsejtekből. A tiszta Langerhans sejtek elkülönítése ilyen esetben jóval egyszerűbb, különösen ha tiszta sejttenyészetet kívánunk használni. A későbbiekben ismertetett módszer a Langerhans sejtek izolálására ebben az esetben nem szükséges, ugyanakkor a módszer mégis előnyös általános alkalmazhatósága miatt. Sok esetben úgy találtuk, hogy az izolálandó mRNS mennyisége növelhető a tenyésztés körülményeinek változtatásával. Így például hormonos kezeléssel növelhetjük az izolálható mRNS mennyiségét. Ezt elérhetjük más módszerre] is, például egy adott hőmérsékleten való tenyésztéssel, a táptalajhoz egy különleges tápanyagot, vagy más kémiai vegyületet keverve. A patkány növekedési hormonját kódoló mRNS izolálásakor az mRNS mennyisége szinergista módon és szignifikánsan nőtt, ha a tenyésztett patkány mirigysejteket tiroid hormonnal és glükokortikoidokkal kezeljük. 2. Az mRNS extrakciója A találmány szerinti eljárás lényeges része a sejt extraktumban lévő ribonukleáz enzim gyakorlatilag .teljes eltávolítása. Az extrahált mRNS molekula egyszálú polinukleotid, semmiféle komplementer szálat nem tartalmaz. így egyetlen foszfodiészterkötés hidrolitikus hasítása azt eredményezi, hogy az egész molekula értéktelenné válik mint teljes genetikai kód. Ahogy azt az előzőekben már közöltük, a ribonukleáz enzim mindenütt előfordul, aktív és különlegesen állandó. Megtalálható a bőrön, nem veszti el aktivitását az általánosan használt mosási eljárások során, és néha még a szerves vegyületeket is szennyezi. Különösen jelentős a probléma, ha a hasnyálmirigy sejtjeinek extraktumával dolgozunk, mivel a hasnyálmirigy az emésztő enzimek forrása, így igen gazdag ribonuklcázban. A ribonukleázos szennyeződés problémája azonban fennáll minden szövet esetén, a jelen szabadalmi leírásban közölt módszer a ribonukleáz aktivitás megszüntetésére minden szövetre alkalmazható. A módszer rendkívül hatásosságát a hasnyálmirigy Langerhans sejtjeiben lévő intakt mRNS sikeres izolálásával mutatjuk be. A találmány szerinti eljárás során, amikor fehérjétől gyakorlatilag mentes RNS-t izolálunk, mind a sejt feltárása, mind a további lépések során kaotrop aniont, kaotrop kationt és a diszulfid-kémiai kötéseket hasító vegyületet használunk. Az ismertetett vegyületek együttes hatását a patkány hasnyálmirigy Langerhans-szigeteiből jó kitermeléssel izolált mRNS-val szemléltetjük, amely termék gyakorlatilag intakt molekulákat tartalmaz. A megfelelő kaotrop ionokat vizes elegyben való oldhatóságuk és hozzáférhetőségük alapján választjuk ki. Előnyös kaotrop kationok például a guanidium-, karbamoil-guanidium-, guanil-guanidium- és a litium-ion. Kaotrop anionként előnyösen használhatunk jodid-, perklorát-, tiocianát- vagy például dijódszalicüát-ionokat. Ezen kationok és .anionok kombinációjakor keletkező sók relatív hatásosságát részben oldhatóságuk határozza meg. így például a litium-jodid-szalícilát hatásosabb denaturáló-szer mint a guanidium-tiocianát, oldhatósága azonban csak körülbelül 0,1 mól és ugyanakkor viszonylag drága. A guanidium-tiocianát előnyös kation-anion-kombinációt reprezentál, mert könnyen hozzáférhető, és vizes elegyben jól oldódik (5. mól). A tiol-származékok, mint például a ß-merkaptoetanol hasítja a fehérjék intramolekuláris diszulfid-kötéseit, a hasítás tiol-diszulfid kicserélődési reakción alapszik. Számtalan tiol-származék hatásos, köztük a ß-merkaptoetanol mellett a ditio•treitol, cisztein, propanol-dimerkaptán és mások. A vízben való oldhatóságuk lényeges, mivel a tiol-származék az intramolekuláris diszulfid-hidakhoz képest nagy feleslegben kell hogy jelen legyen, mivel csak ekkor teljes a kicserélődési reakció. Előnyösen ß-merkaptoctanolt használunk, mivel könnyen beszerezhető és viszonylag olcsó. Az RNS sejtekből vagy szövetekből történő extrakciója során gátoljuk a ribonukleázt, egy adott kaotrop só hatása egyenesen arányos koncentrációjával. Előnyös koncentráció tehát a használható legmagasabb koncentráció. A jelen eljárás során az mRNS sérülés nélküli megőrzése az extrakció során függ a ribonukleáz denaturálásának gyorsaságától a denaturálás mértéke mellett. Valószínűleg ezért használható előnyösebben a guanidium-tiocianát, mint a guanidium-hidrogénklorid, annak ellenére, hogy az utóbbi csak kismértékben gyengébb denaturáló szer. Egy denaturáló szer hatásosságát azzal a küszöb-koncentrációval jellemezzük, amely az adott fehérje teljes denaturálódásához szükséges. Más részről sok protein denaturálódásának sebessége is függ a denaturáló szer koncentrációjától, az adott küszöb értéken ötszörös-tízszeres különbségek is lehetnek (Tanford, Adv. Prot. Chem., 23, 121, 1968). Ez az összefüggés azt jelenti, hogy a guanidium-hidrogénkloridnál csak kevéssé hatásosabb denaturáló szer egy fehérjét azonos koncentráción sokkal gyorsabban denaturálhat. A ribonukleáz denaturálódásának kinetikája és a sejtekből való extrakció közben az mRNS állandósítása közötti összefüggést a jelen leírás előtt nem ismerték fel, és nem használták. Az előzőekben ismertetett elgondolás, ha teljes mértékben igaz, azt jelenti, hogy előnyös denaturáló szer az a vegyület, amelynek a denaturálást kiváltó küszöb-koncentrációja alacsony, és amelÿ vízben jól oldódik. Ezért a guanidiumtiocianátot előnyösebben használhatjuk, mint a litium-dijód-szalicilátot, még abban az esetben is, ha az utóbbi erősebb denaturáló szer, mivel a guanidium-tiocianát oldhatósága jóval nagyobb, és így olyan koncentrációban használhatjuk, amely gyors ribonukleáz-inaktivációt eredményez. Az előzőekből az is nyilvánvaló, miért előnyösebb a guanidum-191 803 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
