191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 zálja az egy szálú DNS foszfodiészter-kötéseit, vagy az egyébként kétszálú DNS egyszálű részeit vagy köralakú végeit (Vogt, Eur. J. Biochem., 33,192,1973). A DNS-ligáz katalizálja az 5’-foszfát- és a 3’-hidroxil-csoporttal rendelkező DNS-szegmensek közötti foszfodiészter-kötés kialakulását, ilyenek akkor alakulhatnak ki, amikor két DNS-darab kohézív végekkel kapcsolódik össze. Az enzim funkciója abban áll, hogy egyébként kétszálú DNS-molekukában lévő egyszálú részeket összekapcsoljon. Megfelelő körülmények között azonban a DNS-ligáz katalizálja két sérült végű molekula kovalens összekapcsolását (SgaTamella, Van de Sande és Khorana, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 67,1468, 1970). Az alkalikus foszfatáz hidrolizálja a foszfát-észtereket, köztük a DNS 5 -terminális foszfátcsoportjait. A találmány szerint úgy járunk el, hogy (1) inzulint kódoló mRNS-t tartalmazó sejteket izolálunk emberi hasnyálmirigyből oly módon, hogy Langerhans- és más sejteket tartalmazó hasnyálmirigy-szövetet egy hidrolízist katalizáló enzimmel és tripszin-inhibitorral kezelünk, majd- a kapott szövet-készítményt frakcionáljuk, célszerűen centrifugálással, (2) a kapott, más sejtekből és sejttöredékektől mentes Langerhans-sejtekből az mRNS-t kaotrop kationt, kaotrop aniont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében extraháljuk. (3) az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal inkubáljuk, .. . (4) az így szintetizált, inzulint kódoló cDNS-t, dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal vagy egy DNS-polimerázzal inkubáljuk. (5) az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk, mely komplementer az E. coli plazmid ’restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel, (6) valamely E. coliból eredő plazmidot egy restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk az 5 -terminális foszfát-csoportot, és (7) a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot egy DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk. A továbbiakban, mint az egész folyamat egy lépését ismertetjük egy jellegzetes DNS-fragmens bevezetését egy DNS-vektorba, mint például egy plazmidba. A plazmidot olyan autonom replikálódó DNS egységek elnevezésére használjuk, amelyek megtalálhatók a mikroorganizmusok sejtjeiben, és amelyek a gazdasejt genomjától függetlenül léteznek. A plazmid genetikailag nincs a gazdasejt kromoszómájához kapcsolva. A plazmid DNS kétszálú, gyűrűvé kapcsolódó molekulaként létezik, molekulasúlya általában néhány millió, bár néhány esetben 10* is lehet, és általában a sejt ossz DNS-tartalmának csak kis %-át képviseli, A plazmid DNS a gazdasejt DNS-étől a kettő közötti méretkülönbség alapján általában elkülöníthető. A plazmidok a gazdasejt osztódásától függetlenül replikálódhatnak, egyes esetekben a kutató szabályozhatja replikációjukat a növekedési körülmények változtatásával. Bár a plazmid zárt gyűrűként létezik, mesterséges eljárással bevezethetünk egy DNS szegmenset a plazmidba, anélkül hogy lényegesen befolyásoltuk volna azt a képességét, hogy replikálódjon, vagy hogy kifejezhesse a benne hordozott információkat. Ily módon a plazmid igen jól használható arra, hogy egy DNS-darabot átvigyünk egy új sejtbe. A rekombináns DNS technológiára használható plazmidok általában szelekciós célokra használható géneket tartalmaznak, például gyógyszerekre való rezisztenciát eredményező géneket, A találmány szerinti eljárás részletes szemléltetésére megadjuk a patkány inzulin génjének izolálását és átvitelét. Az inzulint azért választottuk, mert a klinikai gyógyászat szempontjából rendkívül jelentős, továbbá mert az alapkutatás szintjén is fontos. A megadott eljárást a szakemberek felhasználhatják az inzulin gén más organizmusokból való izolálására, beleértve az embert is. Az inzulint 1922-ben izolálták először. Manapság használata a cukorbaj kezelésére jól ismert. Bár a vágóhidakból szerezhetünk marha és disznó hasnyálmirigyekből inzulint, ahogy a cukorbajos betegek száma világszerte nő, a hormonellátásban hiányok mutatkoznak. Ezenfelül egyes cukorbajos betegek allergiás tünetekkel válaszolnak a marha vagy a disznó hasnyálmirigyből izolált inzulinra. A világ igényét kielégítő mennyiségű emberi inzulin előállítása baktériumokkal olyan módszer, amely ezt a célt kielégítené. A jelen szabadalmi leírás előtt azonban ez a cél nem valósult meg, mivel nem állt rendelkezésre olyan módszer, amellyel az inzulin gént baktériumokba juttathattuk volna. A találmány ismertetése során megadjuk ezt a módszert. Egy adott fehérje genetikai kódját jelentő specifikus bázis-sorrendű DNS-molekula előállításának ismeretében lehetségessé válik az adott nukleotid-sonend módosítása kémiai vagy biológiai módszerekkel, amit követően a kódolt fehérje szerkezete szintén módosul. Ily módon előállíthatunk például olyan módosított inzulint, amely különleges gyógyászati igényeknek tesz eleget. A mikroorganizmusokat képessé tehetjük bármely olyan inzulinnal rokon aminosav-sorrendű fehérjék szintézisére, amelyek rendelkeznek az inzulin alapvető funkcionális tulajdonságaival. Hasonló meggondolások érvényesek a növekedési hormonok esetén is. Ha át tudjuk vinni egy magasabbrendű organizmus közönséges anyagcseréjében részt vevő jellegzetes fehérje genetikai kódját egy baktériumba, úgy lehetőségünk nyílik ennek a fejérjének a baktérium tenyésztésével való előállítására. Megnyílik annak lehetősége, hogy a találmány szerinti módon megváltoztatott mikroorganizmusok által szintetizált proteinnel helyettesítsük a magasabbrendű organizmus protein-igényét, amikor anr\ak képessége ennek a proteinnek a termelésére megszűnt. Felmerül továbbá például annak a lehetősége, hogy a találmány szerinti mikroorganizmus és az ember között szimbiotikus kapcsolatot létesítünk krónikus vagy akut hiánybetegségek esetén, amikor a találmány szerinti eljárással genetikailag megváltoztatott mikroorganizmust beültethetjük, vagy más módon kapcsolatba hozhatjuk az emberrel, ez utóbbi patológiás anyagcsere-hiányának kompenzálására. 191 803 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
