191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
(19) HU MAGYAR népköztársaság országos találmányi hivatal SZABADALMI LEÍRÁS A bejelentés napja: (22)26.05.78. (2l)(RE-630) A bejelentés elsőbbsége: (33) l S. (32)27.05.77.26.04.78. (31) (801.343), (899.002,899.003) (41) 191803 B Nemzetközi osztályjelzet: (81) NSZ04 C12N 15/00 A közzététel napja: (41) (42) 84.11.28. fCÍ^,U , í( Szabadalmi Tár. ^ ^* Tulajdon^. Megjelent: (45) 1988. X. 31. Feltaláló(k): (72) RUTTER William J. professzor, GOODMAN Howard Michael, professzor, ULLRICH Axel, tudományos munkatárs, CHIRGW1N John Mitchell, tudományos munkatárs, PICTET Raymond Rouis, tudományos munkatárs, SEEBURG Peter Hors, tudományos munkatárs, San Francisco, US SHINE John, előadó, Curtin , AU_______________ Szabadalmas: (73) The Regents of The University of California, San Francisco, US (54) Eljárás humán inzulint kódoló DNS szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására (57)KIVONAT A találmány tárgya eljárás humán inzulint kódoló génnek Escherichia coli-ba történő transzformálására alkalmas plazmid előállítására. Az eljárás során inzulint kódoló mRNS-t tartalmazó sejteket izolálunk emberi hasnyálmirigyből oly módon, hogy -Langerhans és más sejteket tartalmazó hasnyálmirigy-szövetet egy hidrolízist katalizáló enzimmel és tripszin-inhibitorral kezelünk, majd a kapott szövet-készítményt frakcionáljuk, célszerűen centrifugálással, a kapott, más sejtekből és sejttöredékektől mentes Langerhans-sejtekből az mRNS-t kaotrop kationt, kaotrop aniont és diszulfid-kötést hasító szert tartalmazó ribonukleáz-gátló szer jelenlétében extraháljuk, az elválasztott mRNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal inkubáljuk, az így szintetizált, inzulint kódoló cDNS-t dATP, dCTP, dGTP és TTP jelenlétében egy reverz transzkriptázzal vagy egy DNS polimerázzal inkubáljuk, az így nyert kétszálú cDNS végeihez önmagában ismert módon olyan kapcsoló DNS láncot kapcsolunk, mely komplementer egy E. coli plazmid restrikciós endonukleázzal végzett hasítása után keletkezett láncvégekkel valamely E. coliból eredő plazmidot egy restrikciós endonukleázzal hasítunk és a hasított plazmidról alkalikus foszfátázzál eltávolítjuk az 5 -terminális foszfát-csoportot, és a kapcsoló DNS-szekvenciát tartalmazó kétszálú DNS-láncot és a kezelt plazmidot egy DNS-ligáz és ATP jelenlétében inkubáljuk.
