191803. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására
1 2 191 803 A találmány tárgya eljárás humán inzulint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó plazmid és E. coli baktérium előállítására. A találmány szerinti eljárással új termékeket állítunk elő. Az új termékek közé tartozik a magasabbrendű organizmusból származó jellegzetes nukleotid-sorrendű DNS-t tartalmazó rekombináns plazmid és az új mikroorganizmus, amely genetikai készlete részeként tartalmazza a magasabbrendű organizmusból származó jellegzetes nukleotid szekvenciát. A szabadalmi leírás során a következő rövidítéseket használjuk: DNS: dezoxi-ribonukleinsav RNS: ribonukleinsav cDNS: komplementer DNS (egy mRNS-ből enzimatikusan szintetizált termék) mRNS: hírvivő (messenger) RNS tRNS: szállító (transzfer) RNS dATP: dezoxi-adenozin-trifoszfát dGTP: dezoxi-guanozin-trifoszfát dCTP: dezoxi-citidin-trifoszfát A: adenin T : timin G: guanin C: citozin Trisz: 2-amino-2-hidroxi-etil-l ,3-propán-diol EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav ATP: adenozin-trifoszfát TTP: timidin-trifoszfát A DNS bázis-sorrendjének biológiai jelentősége abban áll, hogy hordozza a genetikai információt. Ismeretes, hogy a DNS bázis-sorrendje meghatározza a sejt által szintetizált összes fehérje aminosavsorrendjét. Ezenfelül a DNS bázisainak egy része szabályozó szerepet tölt be, szabályozza az összes szintetizált fehérje mennyiségét és a szintézis idejét. Ezeknek a szabályozó elemeknek a természete csak részben ismeretes. Végül a DNS egy-egy száljának bázisait használja fel a sejt a sejtosztódás során bekövetkező DNS-replikációhoz mintaként. Az a mód, ahogy a DNS-ben a bázis-sorrend által meghatározott információ felhasználódik a fehérjék aminosav sorrendjének kialakulásában, olyan alapvető folyamat, amely legfőbb vonásaiban, minden élő organizmusban jelen van. Kimutatták, hogy mindegyik aminosav, amely a fehérjékben megtalálható, egy vagy több trinukleotid vagy triple« által van meghatározva. így mindegyik fehérjének megfelel egy olyan DNS darab, amely az aminosav-sorrendnek megfelelően tartalmazza a tripletteket. A genetikai kódot az 1. táblázatban ismertetjük. 1. táblázat A genetikai kód Fcnilalanin (Phe) TTK Leucin (Leu) XTY Izoleucin (He) ATM Metionin (Met) ATG Valin (Val) GTL Szerin (Ser) ÖRS Prolin (Pro) CCL Treonin (Thr) ACL Alanin (Ala) GCL Tirozin (Tyr) TAK Ilisztidin (Mis) CAK Glutamin (Gin) GAJ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Aszparagin (Asn) Lizin (Lys) Aszparaginsav (ASP) Glutaminsav (Glu) Cisztein (Cys) Triptofán (Try) Arginin (Arg) Glicin (Gly) Befejező jel Befejező jel AAK AAJ GAK CAJ TGK TGG WGZ GGL TÁJ TGA Mindegyik hárombetűs triple« a DNS trinukleo; tidjait jelöli, amelynek 5 vége a baloldalon és a 3’ vége a jobb oldalon helyezkedik el. A betűk a purinvagy a pirimidin-bázisokat jelentik, amelyek a nukleotid-sorrendet kialakítják. A táblázatban a következő rövidítéseket használtuk: A: adenin G: guanin C: citozin T : timin X: T vagy C, ha Y jelentése A vagy G X: C, ha Y jelentése C vagy T Y: A, G, C vagy T, ha X jelentése C Y ; A vagy G, ha X jelentése T W: C vagy A, ha Z jelentése A vagy G W: C, ha Z jelentése C vagy T Z: A, G, C vagy T, ha W jelentése C Z: A vagy G, ha W jelentése A OR: TC, ha S jelentése A, G, C vagy T OR: AG, ha S jelentése T vagy C S: A, G, C vagy T, ha OR jelentése TC S: T vagy C, ha OR jelentése AG J : A vagy G K : T vagy C L: A, T, C vagy G M: A, CvagyT A nukleotid-sorrend átírását aminosav-sorrenddé célzó biológiai folyamatok első lépése a transzkripció (átírás). Ebben a lépésben az elkészítendő fehérje összetételét meghatározó lokális DNS szegmens egy RNS molekulára másolódik. Az RNS a DNS- hez hasonló polinukleotid, azzal a különbséggel, hogy az RNS-ben ribóz van a dezoxi-ribóz helyett és uracil a timin helyett. Az RNS molekulát felépítő bázisok képesek a DNS-ben lévő bázis-párokhoz hasonló párokat kialakítani. Ily módon a DNS-t leíró RNS nukleotid-sorrendje megfelel egymásnak. Ezt az RNS-t hírvivő vagy messenger RNS-nek (mRNS-nek) nevezzük, mivel feladata a genetikai készlet és a fehérje-szintetizáló rendszer összekötése. A sejten belül az mRNS mintaként szerepel abban a komplex folyamatban, amelynek része a sejten belül lévő enzimek és sejtszervecskék sokszorozódása, amely a különleges aminosav-sorrendű fehérjék szintézisének az eredménye. Ez utóbbi folyamatot az mRNS transzlációjának (átfordításának) nevezzük. Gyakran további lépések szerepelnek a sejten belül, amelyek során a transzlációs folyamatokban kialakult megfelelő aminosav-sorrendű fehérje funkcionális fehérjévé alakul át. Az inzulin szintézise kapcsán erre példát ismertetünk. Az inzulin prekurzora egy proinzulinnak nevezett egyszerű polipeptid, amely tartalmazza az A és B inzulin láncokat. Ez a későbbiek során egy másik peptid-lánchoz kötődik, a C pepiidhez (Steiner, Cunningham, Spigelman és Aten, Science, 157, 2
