191743. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin szerkezeti típusú antibiotikumok előállítására
1 2 melanoid-pigmentet és spóratartói rectus-flexibilis típusúak. A Streptomyces sp. N424 nem sorolható be a Streptomyces ciridochromogenes fajba sem, minthogy az utóbbi törzsei vas-pepton agaron melanoid-pigmentet nem termelnek, ezzel szemben tirozin agaron kromogénnek bizonyulnak. A Streptomyces sp. N424 jelű törzs endopigment termelése éppen ellenkezőleg vas-pepton agaron kifejezetten pozitív, míg tirozin agaron negatív. A Streptomyces griseo-Iaqueust a mannit és a szacharóz hasznosítási képesség hiánya különíti el a Streptomyces sp. N424 jelű törzstől. A taxonómiai vizsgálatok szerint az általunk izolált, daunomicint termelő Streptomyces törzs a Hutter javasolta Streptomyces rendszer (R. Hütter: Systematik der Streptomyceten, Basel, 1967) szerinti kulcsfontosságú diagnosztikai bélyegek alapján a Kékszerieszhez és a Streptomyces coerulescens fajhoz tartozik, melynek daunomicint termelő törzse eddig nem volt ismeretes. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás a daunomicin és a daunorubicinol antibiotikumok és gyógyászatilag elfogadható sóik, továbbá antraciklinvázas antibiotikum-származékok szintézisében kiindulási anyagként használható 8-acetil-l-metoxi-7,8,9,10- -tetrahidro-6,8,10,11 -tetrahidrqxi-5,12-naftacéndion, 8-ace til-1 -metoxi-7,8,9,10-tet rahidro-6,8,11 -t rihidroxi-5,12-naftacéndion és 8-/1 -hidroxietil/-1 -metoxi-7,-8,9,10-tetrahidro-6,8,22-trihidroxi-5,12-naftacéndion előállítására asszimilálható szén- és nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon végzett aerob fermentációval, továbbá a képződött termékek kívánt esetben történő elkülönítése, valamint lehetséges és kívánt esetben savaddiciós sóvá alakítása útján, amely abban áll, hogy a Streptomyces coerulescens sugárgomba faj, MNG 00200 sz. alatt letétbe helyezett, Streptomyces sp. N424 jelzésű törzsét vagy annak valamely mutánsát fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük és kívánt esetben a keletkezett daunomicint, daunorubicinolt, 8-acetil-l-metoxi-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,10- -1 l-tetrahidroxi-5,12-naftacéndiont, 8-acetil-l-metoxi-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,ll-trihidroxi-5,12-naftacéndiont és a 8-/l-hidroxi-etil/-l-metoxi-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-5,12-naftacéndiont a fermentléből elkülönítjük, majd egymástól elválasztjuk és kívánt esetben a daunomicint és a daunorubicinolt gyógyászatilag elfogadható savaddiciós sóvá alakítjuk. Az antibiotikum termelésre szolgáló táptalajban a sugárgomba által asszimilálható különféle szénás nitrogénforrások, szervetlen sók, nyomelemek és habzásgátlók lehetnek jelen. Szén- és nitrogénforrásként, illetve energiaforrásként szójalisztet, szójaliszt-hidrolizátumot, kazein-hidrolizátumot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, különféle szénhidrátokat, mint amilyen a glükóz, keményítő, oldható keményítő, dextrin stb., és előnyösen glicerint alkalmazhatunk. Szervetlen sóként használhatunk különféle vas-, magnézium-, és kobalt-sókat. A táptalaj pufferkapacitásának növelésére előnyösen kalciumkarbonátot alkalmazhatunk. Habzásgátlóként növényi olajokat (pálma- napraforgó- és szójaolaj), valamint szilikon típusú szintetikus habzásgátlót (Chinoin 3A) használhatunk. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmust 24-35°C-on, előnyösen 26-32°C-on, legalább 80 órán át, célszerűen 100—150 órán át tenyésztjük. A fermentáció során bioszintetizálódó daunomicin koncentrációját R. C. Pandey és M. W. Tousaint nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerével [J. Chromat. 198, 407 (1980)] határozzuk meg. A fermentáció során keletkező daunomicint és daunorubicinolt a fermentléből szerves oldószeres extrakcióval vagy ioncserélő gyantán való megkötéssel különíthetjük el. Az extrakciós eljárás egy előnyös változata szerint a fermentlét először 50 C-on oxálsawal kezeljük, majd a mikroorganizmus sejtjeit leszűrjük, és a szürletet pH-jának 8,5-re állítása után n-butanollal vagy izo-butanollal extraháljuk. A kapott extraktumot vákuumban 40°C alatti hőmérsékleten besűrítjük és a sűrítményt n-hexánnal hígítjuk, majd vizes sósavval kivonjuk. A sósavas-vizes kivonatba kerül a daunomicin és a daunorubicinol, a szerves fázisban maradnak a 8-acetil-l-metoxi-7,8,9,10-tetrahidro-6,-8,1 l-trihidroxi-5,12-naftacéndion, a 8-acetil-l-metoxi-7,8,9,10-tet rahidro-6,8,10,11 -tetrahidroxi-5,12- -naftacéndion, és a 8-/1 -hidroxietil/-1 -metoxi-7,8,9- -10-tetrahidro-6,8,l 1 -trihidroxi-5,12-naftacéndion. Ez utóbbiak a szerves fázis besűrítésével kapott sűrítményből dietiléter adagolásával leválaszthatók, és a kapott nyers termékek szilikagél oszlopon növekvő kloroform tartalmú n-hexán-kloroform elegyekkel való kromatografálásával elválaszthatók. A vizes fázisból annak 8,5 pH-ra való lúgosítása után a daunomicint és a daunorubicinolt butanollal extraháljuk. A kapott butanolos extraktumot sósavval megsavanyítjuk, majd besűrítjük. A sűrítményben lévő antibiotikumokat sósavval hidroklorid-sóvá alakítjuk és aceton-hexán elegy adagolásával csapadék formájában leválasztjuk. Az ioncserés eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint a fermentlét először 50 C-on oxálsawal kezeljük, majd a mikroorganizmus sejtjeit leszűrjük, és a szürlet pH-ját nátrium-hidroxiddal 4,5-re állítjuk. Ezután a szürletet H ciklusú (karboxil funkciós) kationcserélő gyanta oszlopra visszük, amelyen a daunomicin és a daunorubicinol megkötődik. A megkötésre előnyösen alkalmazhatók például a Wofatit CP (VEB Farbenfabrik, Wolfen NDK), az Amberlite IRC-50 (Fluka AG, Buchs SG, Svájc), vagy a Varion KCO (Balatonfűzfő, Nitrokémiai Művek) ioncserélő gyanta készítmények. Korábban, aminoglükozid-típusú antibiotikumok fermentléből való kinyerésének vizsgálata során megfigyeltük, hogy a fermentléhez közvetlenül hozzáadott H+ ciklusú kationcserélő gyanta nemcsak a tenyészlében oldott antibiotikumot köti meg, hanem az antibiotikumnak a mikroorganizmus sejtjeiről való deszorpcióját is előidézi. így lehetővé válik a tenyészlében lévő antibiotikum teljes mennyiségének megkötése, míg a fermentlé előzetes szűrése esetén az antibiotikum egy része a mikroorganizmus sejtjein kötve marad és a sejttömeg mosásával sem távolítható el. (190 420 számú magyar szabadalmi leírás). Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a daunomicin és a daunorubicinol a fermentlé oxálsavas kezelése után H ciklusú, karboxil-típusú kationcserélő gyantával való kevertetéssel közvetlenül és gyakorlatilag teljesen megköthető. Az antibiotikum 191 743 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
