191743. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin szerkezeti típusú antibiotikumok előállítására
1 2 megkötése után az ioncserélő gyantát ülepítéssel különítjük cl a fermentlétől. Az antibiotikumokat az ioncserélő gyantáról alkálifém- vagy ammóiumklorid tartalmú 1-4 szénatomos alkanol-víz eleggyel, előnyösen metanol-víz eleggyel oldhatjuk le. Az eluátumból a daunoinicin és a datinorubicinol előnyösen bázis formájában kinyerhető. Ez esetben célszerűen úgy járunk el, hogy az eluátumot vákuumban besűrítjük, a sűrítményt pll-jái nátrium-hidroxiddal 8,5-re állítjuk, majd az antibiotikumokat klórozott szénhidrogénnel, előnyösen kloroformmal extraháljuk. A klórozott szénhidrogénes oldatból n-hexán adagolásával leválasztjuk a daunomicin bázist és a daunorubicinol bázist tartalmazó nyersterméket. Ez utóbbiból vizes butanolos közegben sósav adagolásával hidroklorid só készíthető, mely aceton-hexán elegy adagolásával választható le az oldatból. Kísérleteink szerint még kedvezőbben juthatunk a daunomicin és a daunorubicinol savaddiciós sóját, előnyösen hidroklorid sóját tartalmazó nyerstermékhez, ha a klórozott szénhidrogénes, előnyösen klorofomios extraktumhoz vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után a bázis formájában levő antibiotikumokkal ekvivalens mennyiségű, klórozott szénhidrogénben oldott farmakológiailag elfogadható savat, előnyösen sósavat adunk ezután az extraktumot vákuumban besűrítjük, és a sűrítményt petroléterrel hígítjuk. A daunomicin-hidrokloridot és a daunorubicinol-hidrokloridot ismert módon szilikagél oszlopon végzett kromatográfiával választhatjuk el növekvő metanol tartalmú kloroform-metanol elegyekkel végezve az eluciót. A találmány kivitelezését az alábbi példákkal szemléltetjük: 1 1. példa A Streptoinyces coerulescens NMG 00200 burgonyakivonat-glükóz ferdeagar tenyészetéről lemosott spóraszuszpenzióvai beoltunk 8 db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban sterilezett 100-100 ml Dl-jelű táptalajt, melynek összetétele a következő: 0,1 s.% kukoricakeményítő 1 s.% szójaliszt 0,05 s.% kazeinhidrolizátum (kazeinre számítva) 0,2 s.% kukoricalekvár (szárazanyag 50%) 3.8 s.% glicerin 0,5 s.% kalcium-karbonát 0,3 s.%- nátrium-klorid 0,01 s.% kobalt(H)-klorid-víz (1/6) csapvízben. A pH = 7,0 stcrilezés előtt. A táptalajt 121°C-on, 45 percig sterilezzük. Az inokulum tenyészetet 32°C-on 48 órán át síkrázógépen rázatjuk (250 fordulat/perc, 10 cm kitérés), majd a tenyészet 5-5 ml-ével oltunk 120 db 500 ml-es Erlenmcyer-lombikban sterilezett 100— 100 ml DT, -jelű táptalajt, melynek összetétele a következő: 0,1 s.% kukoricakeményítő 1 s.% szójaliszt 0,05 s.% kazeinhidrolizátum (kazeinre számítva) 0,2 s.% ktikoricalckvár (szárazanyag 50%) 8.8 s.% glicerin 0,5 s.% kalcium-karbonát 0,3 s.% nátrium-klorid 0,01 s.% kobalt(II)-klorid-víz (1/6) csapvízben A pH = 7,0 sterilezés előtt. A tenyésztést 28 C-on végezzük. A fermentlé a tenyésztés 120. órájában 160 jug/ml daunomicint tartalmaz. 10 liter 160 jug/ml daunomicin-tartalmú fermentléliez keverés közben hozzáadunk 270 g oxálsavat, A fermentlevet egy órán át 45-50°C-on kevertetjük. Utána leszűrjük, és a micéliumot 2,5 liter vízzel alaposan kimossuk. A szürletet és a mosófolyadékot egyesítjük, + 5°C-re lehűtjük, majd kémhatását 5 n nátriumhidroxiddal pH = 4,5-re állítjuk. Az így kapott oldatot felvisszük 500 ml Wofalit CP-300 típusú H ciklusú kationcserélő gyantából készített oszlopra (magasság-átmérő arány = 10.) Ezután a gyantaágyat 3,5 liter ionmentes vízzel, majd 3,5 liter 50%-os vizes metanollal, végül 3,5 liter -10% vizet tartalmazó - metanollal mossuk. Ezt követően a gyantaágyat 1% nátriumkloridot tartalmazó metanol-víz (9 : l) eleggyel eluáljuk. Az oszlopkromatográfiás frakciók antibiotikum-tartalmát vékonyrétegkromatográfiás módszerrel vizsgáljuk szilikagél G adszorbenst és kloroform-metanol (8 : 2) kifejlesztő elegvet használva. Az antibiotikum-komplexet tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd csökkentett nyomáson a metanolt ledesztilláljuk. Az így kapott vizes sűrítményt 2n nátriumhidroxiddal pH = 8,5-re lúgosítjuk, majd háromszor 250 ml kloroformmal extraháljuk. A kloroformos extraktumot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban 30 C-os vízfürdőn 40 mi-re besűrítjük. A sűrítményből az antibiotikumot 300 ml n-hexán hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékos oldatot egy éjszakán át 0~ 5°C-on tároljuk, majd a csapadékot leszűrjük és foszfor-pentoxid felett vákuumban +5°C-on szárítjuk. Az így kapott daunomicin bázist tartalmazó nyersterméket 32 ml n-butanol-víz-tömény sósav (94 : 5 : 1) elegy ben szobahőfokon szuszpendáljuk, majd a szuszpenzióhoz 320 ml n-hexán-aceton (6 : 4) elegyet adagolunk, és a csapadékos oldatot éjjelen át hűtőben állni hagyjuk. Ezután a csapadékot leszűrjük és foszfor-pentoxid felett szárítjuk, így 2,85 g 55% daunomicin tartalmú daunomicin-hidroklorid nyers termékhez jutunk. E terméket szilikagél-oszlopon végzett adszorpciós kromatográfiával tisztítjuk tovább. A daunomicin-hidroklorid nyersterméket feloldjuk 20 ml vízmentes metanolban majd a kapott oldatot 6 g szilikagéllel összekeverjük és a metanolt vákuumban lepároIjAk. Az így nyert, szilikagélre adszorbeált daunomicin-hidrokloridot 75 g szilikagélből kloroformmal készített oszlopra (magasság-átmérő arány = 6) visszük fel. Az oszlopot kloroform-metanol elegyekkel eluáljuk oly módon, hogy a metanol koncentrációját 3%>-os fokozatokban 23%-ig növeljük. Az oszlopkromatográfiás frakciók aitibiotikum tartalmát vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizáljuk, A daunomicin-hidroklorid 18-21% metanol tartalmú eleggyel, a daunorubicinol-hidroklorid pedig 22-24% metanol tartalmú eleggyel oldódik le az oszlopról. A da micint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban 10 ml-re besűrítjük. A sűrítményhez 30 ml kloroformot adunk, majd 100 ml n-hexánnal 191 743 5 10 15 20 25 30 35 • 40 45 50 55 60 4
