191737. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új immunmodulátor hatású hisztidin-peptidek előállítására
1 191.737 2 mény nem minden esetben pozitív. A levamisol alkalmazásánál kellemetlen mellékhatások is jelentkezhetnek, például láz, bőrgyulladás, bár ezek reverzibilisek. Toxikus mellékhatásai között legsúlyosabb a granulocytopenia (N. A. Hogan és társai: J. Infect. Diseases 138 437, 1978). Jelen találmány célja olyan új, kismolekulájú hisztidin-peptidek előállítása, melyek komplex módon befolyásolják az immunválaszt. A találmány további célja a származékok olyan egyszerű eljárással való előállítása, mely a végtermékek kialakítását racemizáció nélkül és elfogadhatóan jó termeléssel teszi lehetővé. A találmány alapja az a felismerés, hogy a fenti cél elérhető, ha a centrális helyzetű hisztidin a-aminocsoportjához például formíl-metionil, illetce formil- D metionilcsoport kapcsolódik, karboxil-csoportjához pedig fenilalaninészter. A találmány további alapja az a felismerés, hogy az N-terminálisként Boc-metionil-csoportot tartalmazó hisztidil-fenilalanin-észterek immunmoduláló hatása is jelen tős. A találmány tárgya tehát eljárás az (I) általános képletü tri-, illetve tetrapeptidek Q-X-(Y)n-His-(7-P)m-Phe-0R (I) ahol Q, X, P, R, Y, n és m jelentése a fent megadott előállítására. A hisztidin-csoportban nem védett (I) általános képletü tripeptidek (n=0) előállítása több úton oldható meg. Egyik célszerű út a Boc-metionin kapcsolása például az irodalomban leírt hisztidil-fenilalaninmetil-észterhez (R.W. Holley és társai JACS 76 1326, 1954; R.W. Boissonnas és társai: Helv. Chim. Acta 41 1867, 1958) a peptidkémiában elterjedt diciklohexil-karbodiimides módszerrel, előnyösen hidroxibenztriazol jelenlétében. A tercierbutiloxikarbönil-csoport savas hasítással távolítható el. A szabad amínocsoport 2,4,5-triklór-fenil-formiátos kezelésével (J. Martinez és társai Synthesis, 972, 1982) forrnil-tripeptid-észterek nyerhetők. Kevésbé jó termelést eredményező alternatíva a formil-aminosavak, például formil-metionin közvetlen kapcsolása hisztidil-fenilalanin-észterhez diciklohexil-karbodiimides módszerrel, mert a termék tisztítása jelentős veszteséggel járhat. Benzilészterek esetén a Boc-származékok lúgos közegben történő katalitikus hidrogénezésével (J. Martinez és társai. Synthesis, 972, 1982), metilészterek esetén lúgos elszappanosítással szabad karboxilcsoportot tartalmazó származékok is nyerhetők. A D -metionint tartalmazó analógok az L-metionil-peptidek készítésére alkalmas eljárással, azonos módon állíthatók elő. Az N-terminálisként norleucint tartalmazó peptidek esetében előnyösen használható például a Z-Nle-His-N2 H3 azidos kapcsolása fenilalanin-észterekhez. Az N-benziloxikarbonil- és a benzilészter-védőcsoportok egy lépésben katalitikus hidrogénezéssel távolíthatók el. A Z-Nle-OPcp a Z-Leu-OPcp analógiájára (J. Kovács és társai, J. Org. Chem. 32 3696, 1967) állítható elő. Aktív észteres kapcsolással hisztidin-metilészterrel dipeptid-észter nyerhető, mely tovább alakítható a fenti kapcsoláshoz felhasznált hidraziddá. A hisztidin-csoportban védett (I) általános képletü tetrapeptideket (m=1) úgy állíthatjuk elő, hogy valamely His(r-P)-Phe OR (|i) általános képletü dipeptid-származékot — « (II) általános képletben P jelentése benziloxikarbonilcsoport, és R jelentése hidrogénatom kivételével a fenti — kapcsoljuk valamilyen elterjedt peptidkémiai módszerrel, például diciklohexil-karbodiimides módszerrel egy (111) általános képletü A-Y (Hl) vegyűlettel — a (I II) általános képletben A jelentése acidolizissel vagy katalitikus hidrogenolizissel eltávolítható csoport, előnyösen benziloxikarbonil- vagy t-butoxikarbonilesöpört. Ezt követően az A-csoport szelektív eltávolítása után az N-terminális irányában tovább hosszabbítjuk a láncot valamely Q-X általános képletü aminosavszármazék kapcsolásával, előnyösen diciklohexilkarbodiimides módszerrel (Û és X jelentése a fenti). A P és R csoportok lúgos hasítással történő eltávolításával újabb termék nyerhető. A szintézishez felhasznált His-(T-P)-Phe-OR dipeptid bármely, a peptidkémiában használatos módszerrel előállítható, így például a His(r-Z)-Phe-OMe dipeptid esetében a K. Inouye.és munkatársai által az irodalomban közölt módszerrel (J. Org. Chem. 27 4236, 1962). Ugyanebben a közleményben leírt az Y-His(r-P)-Phe-OR általános képletü tripeptid intermedierek közül a Gly-His(r-Z)-Phe-OMe származék. A tetrapeptidek előállításának alternatív útja a felépítő két dipeptid fragmenskondenzációja, előnyösen azidos módszerrel, például Q-X-Y-N2H3 ' kapcsolása His(r-P)-Phe-OR dipeptiddel. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A vékonyrétegkromatográfiás Rf értékeket Kieselgel (DC Alufolien, Merck) lemezeken az alábbi oldószerelegyekben határoztuk meg: A futtató elegy: kloroform — metanol 1:9 B futtató elegy: piridin — jégecet — víz — etilacetát 20:6:11:333 C futtató elegy: n-butanol — jégecet — víz 4:1:1 A kromatogrammok előhívásához 0,1%-os Merck ninhidrin sprayt, továbbá a szokásos klórozás után o-tolidin-KJ oldattal történő előhívást alkalmaztunk. A peptidek lokalizálására felhasználtuk a hisztidinre specifikus Pauly-reagenst is. A példákban az olvadáspontokat °C-ban adjuk meg, az értékek nem korrigáltak. A mérések Boetiusféle olvadáspont meghatározó mikroszkópon történtek. Az oldatok bepárlásához Büchi gyártmányú rotációs vákuumbepárlót alkalmaztunk. Az infravörös spektrumok Spekord 75 IR, (Carl Zeiss, Jéna), az UV spektrumok Spekord UV-VIS berendezéssel készültek. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
