191713. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított detoxikált endotoxint tartalmazó kompozíció előállítására
1 A jelen találmány tárgya eljárás tisztított, detoxikált endotoxint tartalmazó termék (TDE) előállítására, amely termék immuristimulátorként, valamint adjuvánsként alkalmazható. A jelen találmány szerinti eljárásban használt TDE azzal jellemezhető, hogy nem tartalmaz kimutatható mennyiségű 2-keto-3-dezoxi-oktanoátot, m(g foszfort 350 és 475 nmól/ /mg közti mennyiségben, zsírsavakat 1700 és 2000 nmól/mgközötti mennyiségben tartalmaz. Az Enterobacteriaceae családból, akár szülő, akár mutáns törzsből nyert endotoxikus extraktumok ismertek. Ezeket az extraktumokat különböző immunogén tumorok immunterápiájához használják (lásd: Paptides as Requirement for Immunotherapy of the Guinea-Pig line-10 Tumor with Endotoxins /A tengeri malac-10 tumor endotoxinokkal történő immunterápiájához szükséges peptidek/, Ribi és munkatársai: Cancer Immunol. Immunother. 7. kötet, 43—58 /1979/). Az endotoxion-extraktumokról azonban ismeretes, hogy nagyon toxikusak éS ezért csak korlátozottan használhatók rákos tumorok kezelésében. Erőfeszítéseket tettek arra, hogy' az endotoxinokat úgy detoxikálják, hogy tumor-visszafejlesztő képességük megmaradjon. Amint Ribi és munkatársai kimutatták, az endotoxinok detoxikálására ismert olyan kémiái eljárások .amelyek azért megőrzik az adjuváns hatást, mint pl. a szukcinilezés és ftálilezés, ebben az esetben csökkenést váltanak ki mind az endotoxicitásban, mind a tumor-visszafejlesztő képességben. Ezért az eddig végzett kísérletek tisztított endotoxin-termék nyerésére nem voltak sikeresek. A jelen találmányban a TDE előállításához szükséges kiindulási anyagként használt típusú endotoxin extraktumot nyerhetünk bármelyik Enterobacteriae családba tartozó mikroorganizmusból, szülő-törzsekből és mutánsokból egyaránt. A példa kedvéért a következő nemzetségeket adjuk meg illusztrációként az olyan mikroorganizmus-típusokra, amelyeket jól alkalmazhatunk: Salmonella, Shigella, Escherichia, Brucella, Bordetella, Citrobacter, Pseudomonas, Pasteurella, Neisseria, Proteus, Klebsiella és Serratio. Leginkább a következő fajokat használjuk: S. minnesota, S. typhimurium, B. pertussis, B. abortus, S. enteritidis, E. coli, S. typhi, S. marcescens, S. typhosa, Shigella flexni, és S. abortus equi. A kiindulási anyagként alkalmazott endotoxikus extraktumot a számos ismert módszer valamelyikével állítjuk elő (lásd pl.: 1. Webster, M.E., Sagin, JJ7., Landy, M., és Johnson, A.G.: J. Immunoi., 1955,744,55 2. Westphal, O., Luderitz.O., és Bister, F.: Z.Naturforsch., 76,148 /1952/ 3. Westphal, O.: Pyrogens. Polysaccharides in Biology, Tr. Second Macy Conference (kiadó:George F. Springer), Madison, New Jersey, Madison Printing Co., 1957,115 ■ 4. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O.: Eur. J.Biochem., 9,245/1969/ 5. Chen,C.H., Johnson,A.G.,Kasai,N.,Key,B.A. Levin, J., Nowotny, A.: J. Infect., Dis. 128, 543 /1973/ 6. Ribi, E., Haskins, W.T., Landy, M., Milner, K. C.: The Journal of Experimental Medicine 114, 647 119611 7. Lelve, L.: Biochem. Biophys. Res. Comm. 21, 290 /1965/ 2 8. Ribi, E., Milner, K.C. és Pertine, T.:J. Immunology 82,75/1959/ Az előnyös módszert, amellyel endotoxikus kivonatot lehet nyerni, Chen és munkatársai hozták nyilvánosságra, nevezetesen a metanol-kloroformos kicsapást. A metanol-kloroformos csapadékát (MKCs) ezután egy szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk, majd liofilezzük, hogy hidrolizált nyers A lipidet állítsunk elő csökkentett toxicitással és pirogén-hatással, ha a kiindulási endotoxin anyaghoz hasonlítjuk. Ezt az anyagot azután egy olyan oldószerrel kezeljük, amely képes fajlagosan feloldani a zsírsavakat és tisztátalan- Ságokat anélkül, hogy feloldaná a nyers A lipidet. Erre a célra alkalmas oldószer az aceton. A detoxikált, finomított A lipid foszfát-tartalma mintegy fele annak, amelyet a toxikus endotoxinoknál figyeltek meg, azt sugallva, hogy a foszfát-tartalom kapcsolatban van az endotoxinok toxikus hatásával. Az MKCs-vel való reakcióhoz használt előnyös szerves savak a sósav, kénsav és foszforsav és az előnyös szerves savak a toluolszulfonsav vagy a triklór•ecetsav. A reakciót megfelelően 90 °C és 130 °C között célszerű végezni annyi ideig, amely elegendő a teljes hidrolízishez, ez általában 15 és 60 perc között van. A nyers, de toxikált endotoxin készítését véghez lehet vinni olyan módon, hogy a kiindulási anyagot a savval reagáltatjuk egy szerves oldószer jelenlétében, ilyen pl. a kloroform, metanol, etanol és ezek kombinációi. Az így nyert nyers A lipidet acetonban felszuszpendáljuk, az aceton előnyös oldószer a zsírsavak és egyéb tisztátalanságok feloldásához. Az oldószert ezután eltávolítjuk, így nyers, detoxikált endotoxint nyerünk. A nyers, detoxikált endotoxint ezután valamely oldószerben feloldjuk és az oldatot megfelelő kromatográfiás oszlopon, mint pl. molekula-kizárásos kromatográfiás oszlopon, engedjük át, hogy elkülönítsük a TDE frakciókat, amelyeket azután az oldószer eltávolítása után egyesítünk. Az egyik kiviteli formában a nyers detoxikált endotoxin-oldatot Sephadex-oszlopon engedjük át olyan oldószerben, mint pl. kloroform, metanol, aceton, pjridin, éter vagy ecetsav, vagy ezek kombinációi. Az oszlop nyomása változó lehet, de általában az atmoszférikus nyomás és 6JL 105 Pa között van, és az átfolyási sebesség 0,1-10 ml/perc között. A nyers, detoxikált endotoxin-oldatot DEAE cellulóz oszlopon is lehet átengedni azonos nyomás- viszonyok között, amelyet a Sephadex oszlopnál említettünk. Az átfolyási sebességet 2-15 ml/perc között tartjuk. Az alkalmazott oldószerek azonosak azzal, amelyeket a Sephadex-oszlopnál alkalmazunk, bár víz és/vagy dietil-amin minden keverékhez adható kb. 1% koncentrációig. Más módszer, amely alkalmas TDE előállítására nyers, detoxikált endotoxinból, lehet pl. az oldat átengedése kis nyomáson sziÚkagél-60 oszlopon, amelynek szemcse-mérete 25 és 63 mikron között van, és amelyhez kloroformból, metanolból, vízből és ammónium-hidroxidból álló oldószert alkalmazunk. Az előnyös térfogat-arány ezekből a komponensekből az oldószerhez kb. 5025.42. A jelen találmány tárgya tehát egy tisztított, detoxikált endotoxint tartalmazó termái előállítása, amely hatásosan alkalmazható a melegvérű állatok 191.713 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
