191713. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tisztított detoxikált endotoxint tartalmazó kompozíció előállítására
1 191.713 2 immunrendszerének stimulálására. A TDE-t speciálisan mint B-sejt mitogént lehet alkalmazni a límfokinek termelésének stimulálására, a makrofágok stimulálására, vagy mint olyan adjuvánst, amely növeli a melegvérű állatok immunválaszát. A jelen találmány tárgya tehát egy,az immunrendszer stimulálására használható tisztított, detoxikált endotoxin (TDE) előállítása. A jelen találmány szerinti TDE-ben nincs kimutatható mennyiségű 2-ke ton-3- -dezoxi-oktanoát, míg foszfortartalma 350 és 475 nmól/mg, és zsírsav-tartalma 1700 és 2000 nmól/mg között van. A jelen találmány szerinti TDE-t az immunrendszer stimulálására lehet alkalmazni melegvérű állatokban olyan antigének ellen, mint pl. mikro-bakteriális és gomba-sejtek, mikro-bakteriális sejt-fragmensek, vírusok , vírus-alegységek és szintetikus peptidek, amelyek sejt- és vírus alegységeknek felelnek meg. Speciális antigének, amelyeket a TDE bevezetésével fokozott immunválaszra lehet késztetni,pl. a Crytococcus neoformans, Candida-fajok, Chlamyda fajok, Legionella fajok, Clostridiumok, hepatitis, meningitis, Steptococcus fajok, Staphylococcus fajok, Klebsiella fajok, Herpes vírus, Brucella fajok, Bordetella fajok, Yersinia fajok, Pasteurella fajok, Francisella fajok, Listeria fajok és hasonlók. A jelen találmány szerinti TDE B-sejt mitogenicitást mutat, vagyis a TDE, amikor megfelelő dózis-mennyiségben és formában melegvérű állatba vezetjük be, aktiválja a B-limfocitákat, amelyek az antitestek előállításáért felelős sejtek. VIZSGALATOK (1) B sejt mitegenicitás A TDE azzal a képességével jellemezhető, hogy aktiválja a B-limfocitákat, amelyek az antitestek előállításáért felelős sejtek. Ezt az I. Táblázatban mutatjuk be. I.táblázat A tisztított, detoxikált endotoxin mitogén aktivitása Adag 3 H-ti mi din-beépülés (/ig/ml) CPM* * Shr* BALB/c nu/+ 10 34,500 5,0 BALB/c nu/nu 10 38,693 5,6 Módszer: 1 106 sejt/ml-t tenyésztettünk az egyes törzsek bői mitogénnel vagy mitogén nélkül 0,2 mg RPMI -1640 (5% borjú-embrió szérum) táptalajban 96 üre ges mikrotitráló lemezekben. 1 ucl 3H-timidint ad tunk minden egyes üreghez a 48 órás inkubálás 18 órájában és mértük a *H beépülését standard szcin tillációs technikával. * CPM=beütés/perc *äSU ^stimuládós index (2) Interleukin I. termelése A TDE-t lehet alkalmazni a makrofágok !'tal kibocsátott lim fokin ok termelésének stimulálására. Az Interleukin I a makrofágok által kibocsátott oldható immunregulátor, amely felelős a limfodták aktiválásáért a fertőzés helyén. Az interleukin-1 kritikus szerepet játszik, mint az immunválasz erősítője. Rágcsáló makrofágokat helyeztünk el mikrotitráló lemezekre (1- 10*/üreg), minden meghatározást három párhuzamossal végeztünk. Az első üregek 1 ml 50 pg/ml-es standard endotoxin-oldatot kaptak, amelyet a korábban említett függő bejelentésben leírt eljárással összhangban készítettünk. A második üreg-sorozatban az üregek 1-1 ml 5o /ml-es TDE oldatot kaptak, amelyet a jelen találmánnyal összhangban állítottunk elő. Mindegyik ágenst 1 ml M 199 tápközegben szolubilizáltunk, amely még 5% FCS-t (borjú embrió szérum) is tartalmazott. M 199 tápközeget, amely még 5% FCS-t is tartalmazott adtunk az üregek harmadik sorozatához, ezek szolgáltak kontrollként . A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 20 órán át inkubáltuk. A felülúszót eltávolítottuk és hígítottuk, hogy 1:10 arányú felülúszó-desztillált víz oldatot nyerjünk. A felülúszót Gery és munkatársai módszerével (Cellular Immun. 64, 293 /1981/) vizsgáltuk meg interleukin I termelésre. A felül úszó eltávolítása után visszamaradt sejteket lizáltuk 0,1% Triton X-100-at használva. A nyert oldatot 1:10 arányban olyan RPMI 1640 tápközeggel hígítottuk, amely 5% borjú embrió szérumot is tartalmazott. A hígított oldatot interleukin I termelésre megvizsgáltuk olyan módon, hogy mértük a PHA indukált makrofágba a 3H-timidin beépülésének növekedését, amint ezt Gary és munkatársai a fentebb idézett irodalmi helyen leírták. Az eredmények a II. táblázatban találhatók. II. táblázat Vizsgálati anyag Felülúszó válasz Iizátum válasz (50 fig/ml) (1:10 hígítás) (1:10 hígítás) Endotoxin standard 31,137±1,721 51,69512797 TDE 16,782±1,295 66,17812332 Kontroll 3,323+31 12,153+ 497 Amint a II. táblázatban látható az interleukin I termelése a jelen találmány szerinti TDE-ből a lizált sejtben nagymértékben meghaladja a standard endotoxin extraktumból nyert interleukin I termelést. Azonos vizsgálatot hajtottunk végre humán raonocitákat használva rágcsáló makrofágok helyett. Az eredményeket a III. táblázat tartalmazza. III. táblázat Vizsgálati anyag Felülúszó válasz Lizátum válasz (lOpg/ml) (1:50 hígítás) (150 hígítás) Endotoxin standard 42,41811763 51,82111348 TDE 17,91011983 50,6261 813 Kontroll 1,693± 289 15,17311,292 (3) Makrofág aktiválás A jelen találmány szerinti TDE stimulálja a makrofágokat is, amint ezt a makrofágoknak a fluoreszcens gyöngyök fagodtózissal elnyelési képességének méréséből kiderül. 1 • 10* hashártya-váladék sejtet összekevertünk 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
