191609. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás glükóz tartalmú cukorlé izomerizálására
3 191 609 4 kiváló forrásai a találmány kiindulási anyagát képező, glükózzá konvertálandó keményítőnek. Az Egyesült Államokban a kukorica-keményítő különösen kedvelt erre a célra alacsony ára és könnyű előállíthatósága miatt. Minthogy az élelmiszer minőségű glükóz termelése leginkább az enzimes keményítő-hidrolizálási eljárásokkal történik, ehelyütt is ezeket a módszereket részesítjük előnyben. Enzimes hidrolízis eljárásokat írnak le a 4,017,363; 3,912,590; 3,922,196; 3,922,197—201 és 4,284,722 számú amerikai szabadalmi leírások. Tekintve, hogy a jelen találmány szerint előállított fruktóz glükózból származik, célszerű az izomerizálásra szánt bármely keményítő-hidrolizátum glükóz tartalmát a lehető legnagyobbra beállítani. A glükóz termelésére legelőnyösebbek az enzimes eljárások, különösen azok, amelyek olyan enzimek mint a glükoamiláz, valamint a GB 2 097 405A szánni brit szabadalmi leírásban szereplőhöz hasonló elágazásmentesítő enzim kombinációját alkalmazzák. Különösen kedveltek az olyan enzimkombinációk, melyek képesek a folyékony keményítőt párhuzamosan glükózzá és fruktózzá konvertálni. Egyik ilyen kombináció a glükoamiláz, a pullulanáz és glükóz-izomeráz 4,111,750 számú USA szabadalmi leírásban közölt elegye. Ez utóbbi eljárással a szárazanyagra számítva 48 % fruktózt és 50 % glükózt tartalmazó izomerizált hidrolizátum állítható elő, ami ideális a jelen találmány szerinti 53—60% fruktóz-tartalmat eredményező konverzió megvalósításához. A poliszacharidok keinényítő-hidrolizátumból való eltávolítására féligáteresztő hártyát alkalmazó eljárások is lehetségesek; ily módon több mint 99 % glükózt tartalmazó frakciók jönnek létre, melyek szintén ideális kiindulási anyagai a jelen találmány szerinti eljárásnak. Természetesen, keményítő-hidrolizátumból kristályosítással előállított glükóz oldatok is alkalmas nyersanyagait képezik a jelen találmány szerinti módszernek. Előnyös, ha a kiindulási anyagként szolgáló glükóz és/vagy glükóz/fruktóz oldatokat előállításuk egyes fokozataiban tisztítják, abból a célból, hogy nemszénhidrát szennyeződések glükóz-izomerázra gyakorolt káros hatását, továbbá a jelen találmány szerinti magas hőmérsékletű izomcrizáció folyamán színezőanyagok keletkezését elkerüljék, ill. minimálisra szorítsák. Mindamellett nem tisztított keményítő-hidrolizátumok is megfelelők, feltéve, hogy az előállításukra vonatkozó — a 4,376,824 számú USA szabadalmi leírásban előírt — követelményeket betartották. Ha a helyzet úgy kívánja, tisztán glükózt tartalmazó oldat alkalmazása helyett olyan glükóz oldat is felhasználható jelen eljárás szubsztrátumaként, melynek egy része már fruktózzá izomerizálódott. Például, egy 52 % fruktózt tartalmazó izomerizált glükóz oldatot jelen eljárás szerint kezelhetünk úgy, hogy a fruktóz koncentrációja az 52% feletti szintre, az 55— 56 %-os előnyös, vagy akár még magasabb szintre emelkedjék. A jelenlévő szénhidrátok 50 tömeg%-ánál kevesebb fruktózt tartalmazó glükóz oldatokat ismert eljárásokkal állíthatunk elő. A magas hőmérsékletű izomerizációs reakció során keletkező színanyagok túlzott mennyiségének megakadályozására biszulfit-képző adalékokat adhatunk a glükóz/fruktóz alapoldathoz a 3,623,953 számú (28,885 jelű újrakiadás) amerikai szabadalmi leírás ajánlásai szerint. Előnyös, ha a glükóz-izomerázzal érintkezésbe kerülő minden oldatból kiűzzük az oxigént, mert így csökkenthetjük az enzimnek a magas hőmérsékletű izomerizációs reakció során bekövetkező oxidációját, ami inaktiválódáshoz vezethet. Az általunk alkalmazott glükóz-izomeráz enzim az ismert glükóz-izomeráz termelő mikroorganizmusok — nevezetesen Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus, Streptomyces albus, Streptomyces wedmorensis, Streptomyces phaeocliromogenes, Streptomyces bobiliae, Streptomyces olivochromogenes, Streptomyces venezuelae, Aerobacter aerogens, Aerobacter cloacae, ' Bacillus coagulons, Bacillus megaterium, Bacillus fructosus, Acetobacter oxydans, Acetobacter suboxydans, Acetobacter roseus, Acetobacter melanogenus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Lactobacillus gavonii, Lactobacillus lycopersici, Lactobacillus manitopoeus, Lactobacillus pentoaceticus, Pseudomonas hydrophilia, Brevibacterium pentaaminoacidicum, Escherichia intermedia, Leuconostoc mesenteroides, és Paracolobactrum aerogenoides — bármelyikéből elkülöníthető. A Streptomyces sp. ATCC 21,175 kiváló termelője a jelen találmány szerinti eljárásban alkalmazott glükóz-izomeráznak. Mint a korábbiakban említettük, olyan glükóz-izomeráz enzim használata lehet előnyös, amelyik az eljárásunkban alkalmazott viszonylag magas hőmérsékleteken stabilitást mutat. Ilyen például a Bacillus stearothermophilus termelte glükóz-izomeráz, különösen pedig az ATCC 21,365, az NRRL B-3680, NRRL B-3681, NRRL B-3682 jelű Bacillus stearothermophilust tartalmazó csoportból kiválasztott törzsek termelte glükóz-izomeráz, továbbá az Ampullariellafélékhez tartozó mikroorganizmusok, mint Ampullariella digitata, Ampullariella loba la, Ampullariella campanulata, és Ampullariella reguláris (4,308,349 számú USA szabadalmi leírás) által, a Bacillus licheniformis 41 213 sz. Európai szabadalmi bejelentés által, valamint a 74 30588 számú japán bejelentésben leírt fajták hőkedvelő változatai által termelt glükóz-izomé ráz. A fentebb említett mikroorganizmusokon túlmenően jelen találmány számításba veszi ezek mutációinak és variációinak legtágabb értelemben vett használatát. A mutáns glükóz-izomeráz gének ilyen célra kiválasztott egyedei azok, amelyek magasabb hőmérsékleten, nevezetesen 90 C feletti, előnyösen 140 °C-ig terjedő hőmérsékleten stabilak. Ilyen gének a mikroorganizmusok mutációjának előidézésére kidolgozott szokványos technikák — mint besugárzásos és kémiai módszerek - segítségével készíthetők. Másrészt azok a glükóz-izomeráz gének, melyek mérsékelt hőstabilitású enzimet produkálnak, mint pl. bizonyos Streptomyces törzsek, in vitro mutálhatok. A megfelelő mutánsok kiválasztása a mutánsnak a termelő, vagy más organizmusba való visszavezetésével történik, melynek növekedését és újraképződését figyelemmel kísérik, végül pedig vizsgálják a képződő glükózizomeráz termikus stabilitását. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
