191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
11 191 487 12 E. pHU DNS izolálása Az előzetes szűrővizsgálatok során metilén-kék redukciós aktivitást mutató telepeket izoláljuk azokról az eredeti lemezekről, melyekről a szűrőpapír replikák készültek és 100 pg/ml tetraciklint és nalidixinsavat tartalmazó HUM táptalajos agarlernezekre szélesztjiik, hogy különálló telepeket kapjunk belőlük. Mikor a telepek ezeken a lemezeken a maximális méretre nőnek (10-15 nap alatt), a lemezeket szűrőpapír korongokra replikázzuk és az átvitt telepeket derepresszáijuk, majd a pHU DNS-t tartalmazó befogadó sejtek izolálása céljából a fentiekben leírt metilénkék redukciós vizsgálatnak vetjük alá. A második vizsgálat során is festék-redukáló aktivitással rendelkezőnek bizonyuló izolált telepeket az anyalemezekről izoláljuk és 200 ml, 45 pg/ml tetraciklint tartalmazó YEM táptalajok oltására használjuk. A tenyészeteket körülbelül 0,2 elnyelési értékig növesztjük (540 nm), a sejteket összegyűjtjük és Cantrell és munkatársai [Archiv. Microbiol., 131, 102—106 (1982)] plazmid-izolálási eljárásának vetjük alá. Az így nyert részlegesen tisztított kozmid DNS-t használjuk E. coli HB 101 sejtek transzformálására Davis és munkatársai eljárásával [Davis, R. W., Botstein, D., Roth. J. R. A. Manual for Genetic Engineering Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 140— 141 (1980)], azzal a módosítással, hogy mélyhütve tárolt, Morrison módszerével [Morrison D. A., Methods in Enzymol. 68, 326-331 (1979)] készített kompetens E. coli sejteket használunk befogadó sejtekként. A transzformált E. coli sejteket LB táptalajon szelektáljuk 20 pg/ml tetraciklinnel. A kapott transzformánsokat használjuk arra, hogy standard módszerekkel pHU kozmid DNS-t tisztítsunk. Például a fentiekben leírt, baktérium növesztési DNS izolálási eljárásokat és Guerry, LeBlanc, Falkow eljárását [J. Bacteriol, 116, 1064— 1066 (1973)], majd cézium-kloridos etidium-bromidos gradiens centrifugálást alkalmazunk. II. II. pHUl és pHU2 jellemzői A fenti módszerekkel izolált két kozmid pHUl és pHU2. A pHUl hozzáférhető az ATCC 39195 számú Escherichia coli HB 101 (pHUl) törzsből. A pHU2 hozzáférhető az ATCC 39196 számú Escherichia coli HB 101 (pHU2) törzsből. Ezek a biológiailag tiszta tenyészetek az American Type Culture, Collection, Rockville MD, USA állandó gyűjteményében elérhetők. A replikonok egyedülállóak, mivel rekombináns DNS technikával vektor DNS-hez kötött HU DNS-t tartalmaznak. A használt DNS vektor maga (pLAFRl) nem új. Más vektor DNS hasonlóan használható, mindaddig, míg könnyen bejuttatható és fenntartható R. japonicumban, valamint genetikai laboratóriumokban általánosan használt baktériumban, például E. coli-ban. A HU DNS az a beépített DNS szakasz, amely a befogadó, vizsgált törzsekben a fentiekben módon a Hup+ jellemző megjelenését okozza. Az alább felsorolt jellemzők nem tekinthetők korlátozó jellegűeknek és nincs szükség arra, hogy a funkcionális jellemzőket a felsorolt molckula-mcrctű DNS fragmentekhez rendeljük. A. pHUl és pHU2 fizikai jellemzői Mind a pHUl mind a pHU2 kozmid molekulamérete körülbelül 47 kb., így molekulasúlya körülbelül 3 >- 107. A pH U1 és pHU2 EcoRI- gyei, illetve Eco Rí és Bglll kombinációjával végzett restrikciós endonukleázos emésztésekor keletkező DNS- fragmentek közelítő molekulaméretét kilobázispárban a II. táblázatban adjuk meg. A táblázatban csillaggal jelölt fragmentek a pLAFRl kozmid vektorban találhatók, ezért nem a HU DNS fragmentjei. A táblázatban bemutatott eredményeket pHU 1 és pHU2 két órán át, 37 ”’C-on végzett emésztésével kapjuk, 5,5 egység EcoRI (Bethesda Research Laboratories, Inc.) enzimet és/vagy 5 egység Bglll (Boehringer Mannheim, Inc.) enzimet használ vagy egy mikrogram DNS-re. Az emésztésekhez használt puffer összetétele: 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgC!2, 50 mM NaCI és 2 mM ß-merkapto-etanol. A restrikciós endonukleázos emésztések után a DNS-t 89 mM Tris, 2,5 mM EDTA és 89 mM bórsav (pH 8,3) összetételű pufferben készített 0,8 %-os agaróz gélen elektroforetizáljuk, 0,4 kilobázispárnál kisebb további, a restrikciós emésztések során keletkező fragmenteket nem lehetne ezekkel a módszerekkel kimutatni. A HU DNS forrásaként használt DNS-t(R. japonicum 122 DES DNS) eredetileg EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük. Ennek eredményeként a pHUlben és a pHU2-ben levő HU DNS-t könnyen, a szakmában ismert módszerekkel, részleges JEzoRI emésztéssel lehet a pLAFR 1 vektorból kivágni. Általánosan használt eljárások teszik lehetővé azután a HU DNS különböző replikonokba való kötését úgy, hogy a pHU beépített DNS szakaszt számos baktérium fajba átvihetjük. Mivel pLAFRl széles gazdaspecifitású vektor, pHUI-et és pHU2-l számos baktérium fajba bevihetjük, minélfogva példláu! a pHU beépített DNS-t könnyen fenntarthatjuk E. coli-ban, átvihetjük E. coli-ból R.japonicum-ba és fenntarthatjuk R.japonicum-ban. II. táblázat A pHUl és pHU2 DNS-ek restrikciós fragmentjeinek mérete kb. párokban pHUl pHU2 Emésztés Emésztés EcoRI + BglII-vel Emésztés EcoRI-gyel EcoRI-gyel 21,6* 19,0* 21,6* 13,0 7,6 13,0 5,0 5,0 4,8 2,9 2,9 2,9 2,3 2,7 2,3 1,55 1,64* 2,2 0,60 1,55 (dublett) 0,60 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
