191487. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hup gént tartalmazó baktériumtörzs előállítására és nitrogénkötés fokozására
13 191 487 14 pHUl pHU2 Emésztés Emésztés Eco Rí + BglII-vel Emésztés EcoRI-gyel EcoRI-gyel 1,51 1,09* 0,95 0,68 0,60 B. pH Ul és pH U2 funkcionális jellemzői A pHUl-et vagy pHU2-t tartalmazó HB 101 -et R. japonicum PJ17nal-!a1 konjugáltatva a fentiekben leírt eljárás szerint azt eredményezi, hogy a kozmidot bejuttatjuk PJ17na!-ba. A R. japonicum PJI7nal törzs derepresszált sejtjei (lásd 1. szekció, D pont, derepressziós eljárás) melyek pHUl vagy pHU2 DNS-t tartalmaznak, mind metilén-kék mind oxigén-függő hidrogén-felvevő aktivitást mutatnak. A fenti aktivitások a PJ17nal törzsben levő DNS-szakasznak a HU1 vagy HU2 DNS-ekben levő DNS-szakaszokkal való genetikai komplcmentációja eredményeként jönnek létre, és hasonlók a Hup+ R. japonicum 122 DES törzs derepresszált, szabadon élő sejtjei által mutatott aktivitáshoz. A pLAFRl vektort tartalmazó PJ17nal derepresszált sejtjei nem mutatnak hidrogén-felvevő aktivitást. Az oxigén-függő hidrogén-felvevő aktivitást a következő módszerrel mérjük. R. japonicum sejteket 540 nm-en mért 0,25-ös elnyelésig növesztjük 8 ml YEM táptalajban (plazmidot tartalmazó törzsek használata esetén 50 pg/ml tetraciklint tartalmaz). A sejteket centrifugálással gyűjtjük össze és a sejt-üledéket 0,2 ml HUM táptalajban szuszpendáljuk. A szuszpenziót Repaske lemezre szélesztjük és 4 napig a metilén-kék telep szűrővizsgálatnál leírt gázkeverékkel derepreszszáljuk. A sejteket eltávolítjuk a lemezekről és 5 ml 50 mM kálium-dihidrogén-foszfát, 2,5 mM magnéziumklorid (pH 7,0 kálium-hidroxiddal) összetételű pufferben szuszpendáljuk. A szuszpenziót tízszeresre hígítjuk a fenti púderrel és amperometriás módszerre! vizsgáljuk az oxigénfüggő hidrogén-felvétel sebességét Hamus, Carter és Evans módszerével [Methods Enzymol.,69, 731-739 (1980)]. Az alábbiakban leírt növekedési körülmények és eljárások használatával a pHUl és pHU2 DNS- tartalmazó PJ17nal-lal fertőzött szójabab képes csomók képzésére, és ez azt mutatja, hogy nincs hidrogén-fejlődés. Egy, az alábbiakban leírt módon végzett csomóképző (nodulációs) vizsgálatban pHUl-et vagy pHU2-t tartalmazó PJ17nal-lal .fertőzött szójanövények csomókat képeztek, amely azt jelentette, hogy nincs hidrogén-fejlődés. Ezeknek a csomóknak és a 122 DES által létrehozott csomóknak az acetilénredukciós aktivitása összemérhető a szójanövények hasonló befertőzése és növekedése után. A beépített pHU DNS szakasz nem zavarja a PJ17nal-lal abban, hogy hatékonyan csomót képezzen szójabab növényeken és valószínűleg nem fogja egyetlen befogadó Rhizobium fajt sem zavarni abban, hogy hatékonyan csomót képezzen a természetes gazdanövényén. Növényi tesztekben a szójamagokat [Glycine max (L) Merr., Wilkin változat] a következő eljárással felületileg fertőtlenítjük. A magokat 10-20 másodpercre 70 %-os eíanolba mártjuk, 5 —8-szor steril desztillált vízzel öblítjük, 3 percig nátrium-hipoklorit 2 %-os oldatában inkubáljuk, majd még 5—8-szor steril desztillált vízzel öblítjük és 0,8 % agart tartalmazó, fele koncentrációjú nitrogén mentes tápoldatban csíráztatjuk [Harper, J. E., Nicholas, J. C., Physio! Plant, 38, 24-28 (1976)], amelyhez 3 mM kalciumszulfátot adunk. 48 óra múlva a csírázó növényeket 20 percre a kívánt R. japonicum törzs 5 napos YEM táptalajos tenyészetébe merítjük (45 pg/ml tetracikiinnel a transzkonjugánsok miatt). A beoltott csírázó növényeket ezután 250 ml-es lombikokban egyenlő mennyiségű steril homok és vermikuiit keverékébe tesszük. A csírázó növényeket vattadugóval védjük majd növényszobába helyezzük őket (16 órás nappal — 8 órás éjszaka ciklussal) körülbelül 250 pE.m-1 sec-1 besugárzás mellett. A nappali és éjszakai hőmérsékletet közel 28 °C, illetve 23 °C értéken tartjuk. A növények elegendő steril fele erősségű nitrogénmentes tápoldatot kapnak [Harper, J. E., Nicholas, J. C. Physiol. Plant, 38. 24-28 (1976)], hogy nedvesen tartsuk a talajt, anélkül szabadon folyó oldatot kapnánk a lombikokban. A, növényeket 30 nappal a csíráztatás után leszedjük és vizsgáljuk a csomók acetilén-redukcióját és hidrogén fejlesztését és a bakteroid hidrogenáz aktivitását Lepő és munkatársai módszerével [Lepő, J. E., Hickok, R. E., Cantrell, M. A., Russell, S. A., Evans, J. J., J. Bacteriol, 146, 614 — 620 (1981)]. PJ18nal egy másik revertáló Hup R. japonicum mutáns, ATCC 39193. Ezt a biológiailag tiszta tenyészetet az American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, állandó gyűjteményéből szerezhetjük be. A HBI01 (pHUl) vagy HB10I (pHU2) konjugálása PJI8nal-lal ichetövé teszi a kozmidok bejutását PJlSnal ba körülbelül 1 - 3 * IO~3-as gyakorisággal mutatnak metilénkék függő hidrogén felvevő aktivitást a pHUl-et vagy pHU2-t tartalmazó telepek. A Hup+ telepek megjelenési gyakoriságát úgy számítjuk ki, hogy a Hup+ tetraciklin rezisztens telepek számát osztjuk az összes tetraciklin rezisztens telepek számával. A PJ17nal és PJ18nal törzseknek csak azért hiányzik az a képességük, hogy kemolitotrófiásan nőjenek mivel egyetlen pontmutáció következtében Hup~ tulajdonságúak. Az SR törzs, amelyből származnak, képes kemolitotrófiás növekedésre számos Hup + -vá alakított PJ17nal transzkonjugánst a pHU kozmidok bejuttatása utáni kemolitotróf növekedési képesség alapján azonosítottunk. A pHUl és pHU2 kozmidokat nem vizsgáltuk ilyen módon de mivel PJ17na!-t Hup+-vá alakítják, PJ17nal-t kemolitotróffá is kell, hogy alakítsák. Jóllehet mi leírtuk és példákat adtunk találmányunk lényeges pontjaira, a szakember számára nyilvánvaló, hogy anélkül, hogy eltérnénk szabadalmunk lényegétől, változtatások és módosítások tehetők. Szándékunk ennélfogva az, hogy a megadott igénypontokkal lefoglaljuk a találmányunk oltalmi körébe tartozó összes ilyen változtatást és módosítást. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
