191414. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antagonista hatás vazopresszin analógok előállítására
1 191 414 2 4. lépés N-terc-Butiloxikarbonil-L-fenilalanil-L-valil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-L-prolil-N^-tozil-L-arginil-glicinamid 12,35 g (12,5 mmól) Boc-Val-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-ot (3. lépés) 60 ml trifluor-ecetsavban oldunk, majd 30 perc múlva az oldatot keverés közben 600 ml éterbe öntjük. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, és megszárítjuk. Az így kapott H-Val-Asn-Cys (Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-trifluor-acetátot (12,88 g, Rf : 0,12, Rf : 0,25) 32 ml dimetil-formamidban oldjuk, 1,75 ml (12,5 mmól) trietil-amint adunk hozzá, és 5,44 g (15,0 mmól) Boc-Phe-OSu-rel reagáltatjuk. A reakcióelegyet 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, pH-ját trietilamin adagolással 8-on tartjuk. Másnap a dimetilformamidot ledesztillűljuk, a maradékot etil-acetáttal eldolgozzuk, a kivált terméket szűrjük, etil-acetáttal és éterrel mossuk, majd megszárítjuk. A nyers terméket (15,49 g) 75 ml forró etanolban szuszpendáljuk. Lehűlés után a csapadékot szűrjük, etanollal és éterrel mossuk, szárítjuk. 13,33 g (93,9%) Boc-Phe-Val-Asn-Cys(Bzl)Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-ot kapunk. Olvadáspontja: 202— 203 °C (bomlik); Rj: 0,54, Rf: 0,58; [<*]D=-33,2° (c = 1, dimetil-formamid). 5. lépés N-terc-Butiloxikarbonil-O-etil-L-tirozil-L-fenilalanil- L-valil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-L-prolil- NTM-tozil-L-arginil-glicinamid 11,35 g (10,0 mmól) Boc-Phe-Val-Asn-Cys(Bzl)-Pro- Arg(Tos)-Gly-NH2-ot (4, lépés) 57 ml trifluor-ecetsavban oldunk, és 30 perc után az oldatot 570 ml éterbe öntjük. A csapadékot szűrjük, éterrel mossuk, és megszárítjuk. A kapott H-Phe-Val-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)Gly-NH2-trifluor-acetátot (11,70 g, Rj: 0,22, R^: 0,38) 30 ml dimetil-formamidban oldunk, és 1,40 ml (10,0 mmól) trietil amin jelenlétében 4,88 g (12,0 mmól) Boc- Tyr(Et)-OSu-rel (B. példa) reagáltatjuk. A reakcióelegyet keverjük, amíg a kikristályosodó terméktől túl sűrű nem lesz, miközben pH-ját trietil-amin adagolással 8-on tartjuk. Másnap a megszilárdult reakcióelegyet 60 ml etilacetát alatt szétnyomkodjuk, szűrőre visszük, etil-acetáttal és éterrel mossuk. Szárítás után a nyers terméket (14,41 g) 70 ml etanollal forrásig melegítjük. Miután lehűlt, szűrjük, etanollal és éterrel mossuk, majd megszárítjuk. 11,89 g (89,6%) Boc-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn- Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-ot kapunk. Olvadáspontja: 220-222 °C (bomlik); Rj: 0,54, Rf : 0,61; [oí]d = -34,4° (c = 1, dimetil-formamid). 6. lépés N-( ß-Benzilmerkapto-ß, B-ciklopentametilénpropionil)-0-etil-L-tirozil-L-fenilalanil-L-valil-L-aszparaginil-S-benzil-L-ciszteinil-L-prolil-NUJ -tozil-L-arginil-glicinamid 9,63 g (7,76 mmól) Boc-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-ot (5. lépés) 48 ml trifluor-ecetsa''ban oldunk, 30 perc után az oldatot 480 ml éterbe öntjük. A kivált csapadékot szűrjük, éterrel mossuk,és szárítjuk. A kapott H-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn- Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-trifluor-acetátot (9,98 g, Rf 0,30, Rf : 0,47) 20 ml dimetil-formamidban oldjuk, és 2,04 ml (14,5 mmól) trietil-amin jelenlétében 3,15 g (8,71 mmól) Pmp(Bzl)-OSu-rel (C. példa) reagáltatjuk. A reakcióelegy pH-ját trietil-amin adagolással 8-on tartjuk Két nap után 80 ml etil-acetátta hígítjuk, a kivált csapadékot szűrjük, etil-acetáttal, etanollal és éterrel moísuk, majd megszárítjuk. A nyers terméket (10,0 g) 40 ml dimetil-formamidban oldjuk, az oldatot leszűrjük, és 100 ml etanollal hígítjuk. A szuszpenziót másnapig állni hagyjuk, majd leszűrjük. A terméket a szűrőn etanollal és éterrel mossuk. Szárítás után 9,15 g (86,5 %) Pmp (Bzl) -Tyr (Et) -Plie -V al -Asn- Cy s (Bzl) -Pro-A rg (T os) - Gly-NH2-ot kapunk. Olvadáspontja: 226—227 °C (bomlik); Rf : 0,57, Rf : 0,59; {ajD=-4i,5° (c= 1, dimetilforn amid). 7 lépés []-(ß-merkapto-ß,ß-ciklopentametilen-propiomav), 2-0-etil-L-tivozin, 4-L-valin, 8-L-arginin]-vazopresszin 4,51 g (3,13 mmól) Prnp(Bzl)-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn- Cys(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2-ot 100 ml cseppfolyós ammóniában oldva 504 mg nátriummal reagáltatunk. A nátrium oldódása után 1,172 g ammónium-kloridot adunk a reakcióelegyhez, majd az ammóniát elpárologtatjuk. A visszamaradó fehér port 16 ml 0,5 mól/1 koncentrációjú ammónium-hidroxid-oldatban szuszpendáljuk, szűrjük, és még háromszor 16 ml 0,5 mól/l-es ammónium-hidroxid-oldattal mossuk. A sómentesített, nedves peptitíet 1565 ml acetonitrilben szuszpendáljuk, és 1565 ml víz hozzáadásával feloldjuk. Az oldat pH- ját - üvegclektróddnl mérve — 8,5-rc állítjuk, 2,35 ml 1 mól/1 koncentrációjú hidrogén-pcroxid-oldatot adunk hozzá majd 24 óra múlva leszűrjük, és vákuumban bepároljuk A habzás csökkentésére bepárlás közben az oldatot 603 ml ecetsavval hígítjuk. Az ecetsav szagú maradékot (4,8 g) 45 ml acetonitrii és 45 ml vízelegyében oldjuk, két részre osztjuk, és két 7,45X195 etn-es dextrángéloszlopon (Sephadex LH-20, Pharmacia, Svédország) 0,2 mól/1 ecetsavat tartalmazó acetonitril-víz 1 :1 térfogatai ányú eleggyel 150 ml/óra sebességgel kromatografáljuk. Azeluátum elnyelését 280nm-en átfolyó küvettás extinkdóméterrel (Uvicord II, LKB, Svédország) folyamatosa r regisztráljuk. A tiszta termék 30-35 óra után kb. 2 óra alatt eluálódik. A terméket tartalmazó oldatot összegyűjtjük, bepároljuk, a maradékot 30 ml eluensben oldjuk, és az elsővel azonos körülmények között újra kromatografáljuk. A második kromatografálás után a két oszlopról nyert tiszta terméket egyesítjük, 40 ml vízben oldjuk cs liofilezzük. 1,76 g (41,5 %) [l -(/3-merkapto-ß,/3- ciklopentametilén-propionsav), 2,0-etil-L-tirozin, 4-L- valin, 8 L-arginin]-vazopresszint kapunk. Amorf anyag, Rf : 0,7 |a]p = —71,3° (c = 0,168, I ml AcÜll); arninosav anal zis: Asp 1,00, Gly 1,08, Pro 0,94, Cys 0,68, Va! 0,99, T>r + Tyr(Et) 0,94, Phe 1,00, Arg 0,95; víztartalom 4,3%, e :etsav-tartalom 11,6%, tisztasága nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint 96,4 %. A kromatográfiás tisztításnál eljárhatunk úgy is, hogy 1,473 g (1,00 mmól) Pmp(Bzlj-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn- Cys (Bzl) Pro-Arg(Tos)-Giy-NH2-ot a fentiek szerint 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
