191414. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antagonista hatás vazopresszin analógok előállítására
1 191 414 2 oldatban, 8-9 közötti pH-n egy ekvivalensnél kisebb mennyiségű hidrogén-peroxidda! oxidáljuk, végül a kapott (I) általános képletű vazopresszinanalógokat — ahol X és Y jelentése a fentiekben megadott — 40-60 tf.% acetonitrilt, vagy 20-50 tf.% valamely 1 —4 szénatomos alkanolt tartalmazó vizes oldatban dextrán gélen ioncserélő, vagy gélkromatográfiával tisztítjuk. A találmány szerinti eljárásban tehát az antagonista hatású vazopresszin-analógokat az arginin guanidinocsoportján tozil- vagy benziloxikarbonii-csoporttal védett L-prolíi L- vagy -D-arginil-glicinamidból, vagyis az előállítani kívánt vazopresszin-analóg C-terminális tripeptidamid-részéből kiindulva lépésenként építjük fel, a megfelelően védett aniinosnvak, illetőleg az N-terminális helyzetű /3-ben zilmcrkapto-0, /3-cik lopen tamctilén-propionsav aktívésztereinek segítségével. Aktívészterként előnyösen szukcinimid-, pentaklórfenil- vagy pentafluorfenil-észtereket, az aszparagin esetében pedig célszerűen 2,4,5-triklór-fenil-, pentafluorfenil- vagy p-nitro-fenilésztert használunk. A védett intermediereket minden kapcsolási lépés után izoláljuk, és tisztítjuk. Tisztaságukat így kromatográfiásan ellenőrizhetjük, az anyagokat olvadáspontjukkal, forgatóképességükkel és/vagy Rf értékükkel azonosíthatjuk. A pentapeptidamíd-fázistól kezdve - kihasználva a védett intermedierek feltűnően rossz oldhatóságát - a kapcsolási reakciók termékét oldószeres - előnyösen etilacetátos — kicsapássai izoláljuk, és oldószeres, előnyösen etanolos mosással, vagy etanolos szuszpenziójának felforralásával, visszahűtésével és szűrésével tisztítjuk meg az acilező aktívészter fölöslegétől, és a különböző melléktermékektől. A védett vazopresszin-analógok védőcsoportjait — önmagában ismert módon — cseppfolyós amrnóniás oldat ban, számított mennyiségű nátriummal távolítjuk el. Kísérleteink során azt találtuk, hogy a szabad HS- csoportokat tartalmazó (IV) általános képletű szabad peptidamid-származékok vízben igen rosszul oldódnak. Ezt a tulajdonságukat a találmány szerinti eljárásban az amrnóniás oldat bepárlási maradékának sótalanítására használjuk ki. A találmány szerint ezt a bepárlási maradékot vízzel mossuk, majd a visszamaradó peptidet 40-60 tf.% acetonitrilt vagy valamely 1—4 szénatomos alkanolt tartalmazó vízben feloldva közelítőleg 10~3 mól/liter koncentrációjú oldatot készítünk. Ez a koncentráció előnyös az oxidációs lépésben. Az oldat pH-ját tömény ammónium-hidroxid-oldat, vagy. ecetsav felhasználásával 7-nél nagyobb, előnyösen 8-8,5 közötti értékre állítjuk be (célszerűen üvegelektróddal mérve), majd a peptid HS-csoportjait egy ekvivalensnél kevesebb, előnyösen 0,75-0,85 ekvivalensnyi hidrogén-peroxid hozzáadásával díszulfiddá oxidáljuk. Az oxidáció lezajlása után az oldatot bepároljuk, a nyers terméket 40—60 tf,% acetonitrilt vagy 20-50 tf.% valamely 1-4 szénatomos alkanolt, előnyösen etanolt tartalmazó vizes oldatban ioncserélő vagy gélkromatográfiával tisztítjuk dextrán gélen. Előnyös a Pharmacia, Svédország gyártmányú, Sephadex LH 20 jelű dextrán gél, illetve a CM-Sephadex C-25 jelű karboximetilezett dextrán gél. A kiindulási anyagként használt, guanidino-csoportján védett karboxilvégi tripeptid-amidot önmagában ismert módon állítjuk elő, például a szakirodalomból [Hoppe Seyler’s Z. Physiol. Chem., 361, 153. (1980)] ismert Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2 terc-butoxikarbonilcsoportjának savas hasításával. Eljárhatunk úgy is, hogy Z-Arg(Tos)-OH klór-szénsav-izobutil-észterrel képezett vegyes anhidridjet H-Gly-OMe-rel reagállatjuk, és a kapott Z-Arg(Tos)-GJy-OMe benziloxikarbonil-csoportját hidrogénezéssel eltávolítjuk. A szabad dipeptid-észtert Boc-Pro-OSu-rel acilezzük, majd a védett tripeptíd-észtert amidáljuk, és a kapott Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-NH2 terc-butoxikarbonil-csoportját savval lehasítjuk. Az eljárás előnye, hogy a védett peptid szintézise oldatban történik az intermedierek izolálásával, tisztításával, és adott esetben azonosításával. A szintézis során alkalmazott műveletek korlátlanul nagyíthatók, és a gyógyszeripar általánosan alkalmazott készülékeiben kivitelezhetek. További előnyt jelent az antagonista hatású vazopresszin-analógok előállításánál, hogy az eljárás szerint a diszulfid-kötés oxidativ kialakítása a szokásos koncentrációkban - az ismert eljáráshoz viszonyítva tízszer kisebb térfogatban is megvalósítható, és az oxidáció a találmány szerinti pH-tartományban megvalósítva kevesebb melléktermék képződésével jár. Előuye még az eljárásnak, hogy a végtermék tisztítása egyszerűsödik: kálium-ferricianid helyett a hidrogén-peroxid alkalmazása feleslegessé teszi az ioncserélő gyanta haszlálatát, a végtemiék sómentesítése oszlopkromatográfia helyett egyszerű mosással megoldható. A kromatográfiás 'isztításnál a szerves oldószer-tartalmú eluensek hasznáata megszünteti a termék aggregációját és kötődését az oszloptöltet vázához, ezzel megszünteti a sávok elnyúását, fokozza az elválasztás hatásfokát, csökkenti a tisztításhoz szükséges folyadék és oszloptérfogatot. A találmányunk előnyös, ipari megvalósításra alkalmas voltát igazolja, hogy 1 mmól védett peptid előállításához' összesen csak 49,5 mmól acilező aminosav-származék és 2,08 liter oldószer szükséges, az oxidációs lépésnél a reakcióelegy térfogata csak 2,4 liter/mmól végtermék, is a kromatográfiás tisztításhoz is csak 13,1 liter oszlop térfogatra van szükség. (A technika állásához tartozó ismertetett megoldáshoz képest az aminosav-származék szükséglet hétszer, az oldószer szükséglet hatszor, az oxidációs reakcióelegy térfogat tizennyolcszor, a kromatagrafáló oszlop térfogat pedig háromszor kisebb.) Az antagonista hatású vazopresszin-analógokat a találmány szerinti eljárással a kromatográfiás tisztításnál használt eluens összetételétől függően többféle addíciós só, mint acetát, formiát stb. alakjában kaphatjuk. A sótól a bázis önmagában ismert módszerekkel szabadítható föl. A szabad bázis savakkal más gyógyászati célra akalmazható addíciós sókká alakítható. E célra használhatunk szervetlen savakat, mint sósavat, kénsavat, foszforsavakat és szerves savakat, mint hangyasavat, hosszabb srénláncú zsírsavakat, tejsavat, borkősavat, citromsavat, n aleinsavat, valamint aminosavakat, mint aszparaginsavat, glutaminsavat stb. A találmány szerinti eljárással készült antagonista hatású vazopresszin-analógok gyógyszerkészítmények formájában kerülhetnek gyógyászati felhasználásra. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vazop esszin-analógokat enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyagok kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények lehetnek srilárd liofilizátumok, amikor vivőanyagként a vazopresszin-analógokkal nem reagáló vegyülelek, például mamiit, tejcukor keményítő jöhetnek számításba. Lehetnek oldatok és szuszpenziók, valamint emulziók, melyek különböző, semleges, tartósító és stabilizáló segédanya3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
