191414. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antagonista hatás vazopresszin analógok előállítására
1 191 41 i 2 A találmány tárgya új eljárás az (1) általános képletű vazopresszin-analógok - e képletben X 0-(l-3 szénatomos)-aikil-L-tirozii- vagy -D-tirozilcsoportot, és Y L- vagy D-arginil-csoportot jelent -(111) általános képletű nyílt láncú, védett peptidamidszármazékok — ahol X és jelentése a fentiekben megadott, és VV N^-tozil-L- vagy -D-arginil-csoportot, vagy N5, N“ -di-(benziloxikarbonil)-L- vagy -D-arginil-csoportot jelent — védőcsoportjainak önmagában ismert módon történő lehasításán, és a kapott (IV) általános képletű szabad peptidamid-származékok - ahol X és Y jelentése a fentiekben megadott — oxidációján át történő előállítására. Ismeretes, hogy a vesében képződő vizelet mennyiségét az agyalapi mirigyben termelt antidiuretikus hormon, az (IA) képletű vazopresszin szabályozza. M. Manning és munkatársai újabban azt találták, hogy a vazopresszin (I) általános képletű, az 1-helyzetben j3-mcrkapto-j3./3- ciklopcntamctilén-propoionsav-, a 2-helyz.ctben O-alkil- L- vagy -D-tirozin-, a 4-helyzetben L-vaiin- és a 8-helyzetben L- vagy D-arginin-csoporttal helyettesített analógjai (a továbbiakban: antagonista hatású vazopresszinanalógok) a vazopresszin vizeletmennyiség-csökkentő (antidiuretikus) hatását antagonizálják (M. Manning és munkatársai: J. Med. Chem., 24, 701. (1981) és 25, 45. (1982)], így alkalmasak lehetnek a vazopresszin-túltermelés következtében fellépő kóros tünetek (Schwartz- Bartter-szindróma) gyógykezelésére, Manning és munkatársai az idézett munkákban eljárást is írtak le ezeknek az antagonista hatású vazoprcsszin-analógoknak az előállítására, A fentiekben idézett közlemények, valamint a 61 356 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés szerint a fent meghatározott (I) általános képletű peptideket szilárd fázison történő lépésenként! felépítéssel szintetizálták. A módszernek hátránya, hogy megnehezíti a reakciók méretnövelését, és az intermedierek tisztaságának ellenőrzését. Emiatt ez az eljárás nem alkalmas a szóbanforgó termékek nagyobb méretekben történő, gazdaságos és ellenőrzött ipari előállítására. A szilárd fázisú peptid-szintézis során a szilárd hordozóhoz kötött peptid aciiezésénél a védett aminosav-származékokat és a kapcsoláshoz használt reagenseket is legalább kétszeres feleslegben kell alkalmazni a reakció teljessé tétele érdekében [R. B. Merrifield: J. Am. Chem. Soc., 85, 2149. (1963); R. B Merrifield: Biochemistry, 3, 1385. (1964)]. Emellett nagy az eljárás oldószer-szükséglete is. További hátrány, hogy a hordozóhoz kötött intermedierek közvetlenül nem azonosíthatók, minőségük közvetlen vizsgálattal nem ellenőrizhető. A hordozóhoz kötött intermediereket nem ’ehet tisztítani, igya terméket szennyező csonka és hiányos szekvenciák képződése nem kerülhető el. Ezeknek a hátrányoknak tulajdonítható, hogy ezt a módszert ipari szintézisnél még nem alkalmazták. Manning és munkatársai idézett munkájukban az antagonista hatású vazopresszin-anaiógok szilárd hordozón történő lépésenkénti felépítése során az oldalláncok védelmére a |3-merkapto-j3,/?-ciklopentametilén-propionsavná! és a ciszteinné! benzil-csoportot, az argininnéi pedig tozil-csoportot használtak. A szintézis végén a védett peptidet ammonolízissel hasították le a hordozóról, majd cseppfolyós ammóniában fémnátriummal távolították el a védőcsoportokat, és a diszulfid-kötés kialakítása céljából káíium-ferricíaniddal oxidálták a 2 szabad peptidet, A gyűrűs diszulfid képződését eredményező oxidációt - minthogy a szabad HS-csoportokat tartalmazó peptid a hidrofób helyettesítések következtében vizben sokkal rosszabbul oldódott, mint az ismert vazopresszin-analógok — csak úgy tudták végrehajtani, logy a cseppfolyós ammóniás oldat hepárlása után visszamaradt szabad pepiidet 10 %-os vizes ccctsav-oldnttan oldották, az oldatot vízzel mintegy 10-4 mól/liter koncentrációjúra hígították, a híg oldatot tömény ammónium-hidroxid-oldattal semlegesítették, és feleslegben alkalmazott kálium-feíncianid-oldattal oxidálták a szabad peptidet. Az említett megoldások szerint az oxidáció után kapott termék kinyerését és tisztítását három lépésben végezték el. Először ioncserélő gyantával eltávolították a kálium-feniciaiiid feleslegét, és az oxidálószer redukciója során képződött termékeket, majd az így tisztított hig vizes oldatot liofilezték, a kapott sótartalmú pepiidet — a vazopresszin-analógok híg vizes oldatokban észlelhető erős sómegkötő készsége miatt Scphadcx G 15 töltetű oszlopon 50%-os ecetsav-oldatban kromatografáíva sőtalanították [Manning és munkatársai: J. Chromaíogi., 28, 396. (1968)] J, és végül újabb gél-krotvniogra fái ássa! [Sepltadex G-15 tölteten, 0,2 mól/liter koncentrációjúecetsav-oldattal] tisztították. Az ismert eljárás méretnövelését — a szilárd fázisú szintézis már említett hátrányain kívül - a reagensek nagy feleslegben való alkalmazása és az oxidációnál haszná’t rendkívül nagy oldószertérfogat és többlépcsős gélkromatográfia nagyon megnehezíti és gazdaságtalanná terzi. Az eljárás hátrányainak szemléltetésére megadjuk, hogy 1 mmól védett [l-(/3-merkaptüiß,/3-ciklopentametilér.-propionsav), 2-0-etil-L-tirozin, 4-L-valin, 8-L-arginin]vaïopresszin előállításához 348 mmól amino sav-származék és 12,6 liter oldószer, az oxidációs lépéshez és tisztításhoz pedig 43,4 liter oxidációs reakcióelegy térfogat és 41,2 liter oszloptérfögat szükséges. Ilyen feltételek medett ipari eljárás gazdaságosan nem hajtható végre. Meglepő módon azt találtuk, hogy az (1) általános képletű vazopresszin-analógokat ipari megvalósításra alkalmas módon, kis reagens ráfordítással és oldószer szükséglettel, jó kitermeléssel, tisztán, úgy állíthatjuk elő, hogy így (II) általános képletű tripeptid-amidból — ahol W Nw-tozil-L- vagy -D-arginil-csoportot, vagy N5, Nw-di-(benziloxikarbonil)-L- vagy -D-arginil-csoportot jelent — kiindulva, az amino-csoporton savval lehasítható védőcsoporttal, és adott esetben az —SH csoporton benzilcsoporttal védett megfelelő aminosavak aktív észtereinek felhasználásával, egymást követő acilezési, szerves oldószerrel végzett kicsapási és tisztítási, majd védőcsoport lehasítási lépések végrehajtásával oldat fázisban egy (III) általános képletű nyílt láncú, védett peptidamic:-származékot — ahol X és W jelentése a fentiekben megadott — állítunk elő, a kapott (III) általános képletű, nyílt láncú, védett peptidnmid-származék — ahol X cs W jelentése a fentiekben megadott — védőcsoportjait önmagában ismert módon, előnyösen cseppfolyós ammóniában fémnátriummal lehasítjuk, majd a kapott (IV) általános képletű szabad peptidamid -származékot — ahol X és Y jelentése a fentiekben megadott — vízzel mossuk, és 40—60 tf.% acetonitriit, vagy egy 1—4 szénatomos alkanolt tartalmazó vizes 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
