191386. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces törzsek antibiotikum termelőképességének fenntartására és fokozására
t 191 386 2 A találmány daunomicint termelő Streptomyces törzsek termelőképességének fenntartására és fokozására vonatkozik. Ismeretes, hogy antibiotikumokat termelő Streptomyces törzsek termelőképessége sok esetben fokozható, ha a saját an tibiotikumokkal szemben rezisztens variánsokat szelektálnak ki. [A. F. Teteryatnic és L. S. Bryzgalova: Antibiotiki 13, 252 (1968); G. A. Trenina és E. M. Trutneva: Antibiotiki Moscow 11, 770 (1966); H. B. Woodruff: Symp. Soc. Gén. Mocrobiol. 16, 22 (1966)]. Ezzel szemben a daunomicint termelő Streptomyces coerulescens törzsnél azt a meglepő megfigyelést tettük, hogy ha egy, a törzs által nem termelt, és a daunomicintől mind szerkezetileg, mind a bioszintetikus utat illetően jelentősen eltérő antibiotikumot, a streptomicint alkalmaztuk szelektáló anyagként — ily módon a törzs streptomicin-rezisztenciáját MIC = 0,50 jug/ml-ről 200 íig/ml-re emeltük — a rezisztensek között igen nagy gyakorisággal volt található magas termelőképességű variáns. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás daunomicint termelő Streptomyces coerulescens törzsek termelőképességének fenntartására és fokozására, amely abban áll, hogy a termelő törzs spóráit streptomicinszulfátot tartalmazó tápagarra szélesztjük, majd a kinőtt telepeket streptomicin-szulfát tartalmú táptalajra izoláljuk. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a termelő törzset olyan szintetikus tápagarra szélesztjük, amely célszerűen 10-100 jUg/ml streptomicin-szulfátot tartalmaz. Az izolált rezisztens szubkultúrákat termelőképesség szempontjából ellenőrizzük. A fermentációkat előnyösen streptomicin-szulfát jelenlétében nőtt inokulum-tenyészetekkel oltjuk. A találmány arra is lehetőséget nyújt, hogy megakadályozzuk a termelő variánsok termelőképességének csökkenését, ami ismételt átoltások esetén minden antibiotikum termelő törzs esetében bekövetkezik. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa Streptomyces coerulescens N-424 spóráit az alábbi 45 összetételű ferdeagarra oltjuk: vízoldható keményítő kazein hidrolizátum (Bacto-casitone) kálium-nitrát 0,1 % dikálium-hidrogén-foszfát magnézium-szulfát-víz 0,05 % (1/7) 0,05 % nátrium-klorid 0,05 % vas(lI)-BZulfát (1/7) . 0,01 % Bacto agar (Difco) desztillált vízben. 1,5 % 10 Sterilezés előtt a táptalaj 7,0 pH-jú. A kultúrákat 6 napig, 28 °C-on növesztjük, majd a spórákat 3 ml fiziológiás konyhasó oldattal lemossuk, és a szokásos módon, megfelelő hígításban leszélesztjük az 15 előbbi összetételű agarlemezekre. A lemezek egy-egy részéhez 0,25-0,5-1,0, ill. 2,0 pg/ml steptomicin-szulfátot adunk. A lemezeket 28 °C-on 6 napig inkubáljuk, mialatt a spórák izolált telepeket fejlesztenek, melyekből 50—50-et a lemezeknek megfelelő összetételű ferde- 20 agarra izolálunk. A ferdeagar tenyészeteket 28 °C-on, 6 napig tartó növesztés után 3 ml fiziológiás konyhasóoldattal lemossuk. Az így kapott szuszpenzió 1 ml-ével 100 ml alábbi összetételű tápközeget oltunk: 25 kukoricakeményítő 0,1 % szójaliszt 1,0% kazein hidrolizátum (kazeinre számítva) 0,05 % kukoricalekvár 30 (szárazanyag 50 %) 0,2 % glicerin (térf./térf) 7,0% kalcium-karbonát 0,5 % nátrium-klorid 0,3 % kobalt(II)-klorid-víz 35 (1/6) 0,01 % csapvízben. ApH = 7,0 sterilezés előtt. 40 A tenyészeteket 48 óráig, 32 °C-on síkrázógépen rázatjuk (250 ford./perc, 10 cm kitérés), majd e kultúra 5 ml-ével oltunk 100 ml előbbi összetételű táptalajt, melyet 28 °C-on 168 óráig rázatunk síkrázógépen (250 ford./perc, 10 cm kitérés). A fermentlevek dáunomicin-tartalmát vékonyrétegkromatográfia után bioautográfiával határozzuk meg. \ kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze: 2% 0,5 % 50 1. táblázat A variánsok megoszlása termelőképességük alapfán A tápagarhoz A telepképzűk jzoyit Az izolált variánsok daunomicin termelőképessége adott strepto- számának variánsok rázott tenyészetben pg/ml micin- csökkenése ___________________________________________ szulfát %-ban szama 10 10-20 20-50 50-100 0 0 50 48 2 0 0 0,25 42 50 45 3 2 • 0 0,50 87 50 33 11 4 2 1 99,9 50 28 12 6 4 2 100 0 — — — — 2
