191386. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces törzsek antibiotikum termelőképességének fenntartására és fokozására
1 191 386 2 A táblázat adataiból látható, hogy a kiindulási törzs egyedei közül 96 %-nak a daunomicin-termelése nem haladta meg a 10 Mg/ml-t. Ezzel szemben az 1 Mg/ml streptomicin-szulfátra rezisztens egyedek 20 %-a 20-100 Mg/ml közötti daunomicin termelést mutatott. 5 Az 1. példában leírt módon, 1 Mg/ml streptomicinszulfát tartalmú táptalajról izolált szubkultúrát átoltunk 1,56-3,12-6,25-12,5—25-50—100 Mg/ml streptomicin-szulfátot tartalmazó azonos összetételű ferdeagar táptalajokra. 6 napig 28 °C-on történt tenyésztés után e 15 műveletet megismételjük, oltóanyagként használva azt a ferdeagartenyészetet, amely a legmagasabb streptomicinszulfát koncentráció mellett még növekedést mutatott, mindaddig, míg 100 Mg/ml streptomicin-szulfát mellett határozott növekedést nem kaptunk. Ez 2-3 lépésben 20 következik be. A 100 Mg/ml streptomicin-szulfátot tartalmazó ferdeagartenyészetet 3 ml fiziológiás konyhasó oldattal lemossuk, és a mosófolyadék 1 ml-ével beoltunk 100 ml alábbi összetételű tápközeget: 25 kukorioakeményítő szójaliszt 1,0 % kazein hidrolizátum 0,1 % 1,0 % (kazeinre számítva) kukoricalekvár 0,05 % 30 (szárazanyag 50 %) 0,2% glicerin (térf./térf.) 7,0% kalcium-karbonát 0,5% nátrium-klorid 0,3% 35 kobaIt(II)-kiorid-víz (1/6) csapvízben. 0,01 % A pH = 7,0 sterilezés előtt. 40 A tenyészetek egy részéhez 10 Mg/ml streptomicinszulfátot adunk. A lombikokat 32 °C-on, 48 óráig síkrázógépen rázatjuk (250 ford./perc, 10 cm kitérés), majd e kultúrák 5 ml-ével oltunk 100 ml előbbi összetételű táptalajt, mely streptomicin-szulfátot nem tartalmaz. A tenyészeteket síkrázógépen, 28 °C-on, 168 óráig rázatjuk (250 ford./perc, 10 cm kitérés). A kapott eredményeket a 2. táblázatban mutatjuk be. 3. példa A 2. példában leírt módon készült, 50 Mg/ml streptomicin-szulfát jelenlétében nőtt ferdeagartenyészetet 3 ml fiziológiás konyhasó oldattal lemosunk, és a mosófolyadék 3 ml-ével 300 ml alábbi összetételű tápközeget oltunk: kukoricakeményítő 0,1 % szójaliszt 1,0% kazein hidrolizátum (kazeinre számítva) 0,05 % kukoricalekvár (szárazanyag 50 %) 0,2 % glicerin (térf./térf.) 7,0 % kalcium-karbonát 0,5 % nátrium-klorid 0,3 % kobalt(II)-klorid-víz (1/6) 0,01 % csapvízben. A pH = 0,7 sterilezés előtt. Oltás előtt 10 Mg/ml streptomicin-szulfátot adunk a táptalajhoz. A tenyészetet 32 °C-on, 48 óráig síkrázógépen rázat: juk (250 ford./perc, 10 cm kitérés), majd a tenyészettel 5 liter előbbi összetételű, de streptomicin-szulfátot nem tartalmazó táptalajt oldunk, melyet 10 literes üvegfermentorban sterileztünk. Hab zásgáti óként pálmaolajat használunk. 1 lit/perc levegőztetés és 500 ford.perc kevertetés mellett 28 °C-on 168 óráig fermentálunk. Ily módon 250Mg/ml daunomicin bioszintetizálódik. 5,0 liter, 250 Mg/ml daunomicint tartalmazó fermentléhez keverés közben hozzáadunk 135 g oxálsavat. Ezután a fermentlevet egy órán át 35-50 °C-os hőmérsékleten tartjuk és közben kevertetjük. Utána szűrjük, majd a micéliumot mossuk 1,5 liter ionmentes vízzel. A szűrletet és mosófolyadékot egyesítjük és lehűtjük +5 °C-ra, majd 5n nátrium-hidroxid oldattal pH = 4,5-re állítjuk. Az így kapott oldatot felvisszük 400 ml Wofatit Cp- 300 H+ ciklusú kationcserélő gyantával töltött oszlopra . Az oszlopon átfolyt fermentlé maradék aktivitása 10 Mg/ml. Az oszlopot mossuk 1,0 liter ionmentes vízzel, majd 1,0 liter 50 % metanol tartalmú ionmentes vízzel, végül 1,0 liter 90 % metanol tartalmú ionmentes vízzel. Az így kimosott gyantaoszlopot eluáljuk 10 % vizet tartalmazó metanollal, amely 1 % nátrium-kloridot tartalmaz. A daunomicint tartalmazó frakciókat 2. táblázat Az inokulum-tenyészethez adott streptomicin-szulfát hatása a daunomicin hozamra Daunomicin hozam Mg/ml Streptomicin-szulfát Mg/ml ______________________ 1. kísérlet 2. kísérlet 3. kísérlet 4. kísérlet 5. kísérlet 0 95 110 105 86 120 10 183 240 210 195 235 3
