191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
15 191 292 16 dot adunk, és a tenyésztést még 4 napig folytatjuk. A tenyészközeget centrifugáljuk, és a felső folyadékfázist analizáljuk, mellyel ribavirin képződése egyáltalán nem mutatható ki. 2. példa Az I. példa szerintivel azonos mikroorganizmustörzset az 1. példához hasonlóan tenyésztjük (de mindegyik tenyészközeg 10 ml), majd ezután a tenyésztett sejteket centrifugáljuk, és mindegyikhez 1 ml steril vizet adunk, hogy sejtszuszpenziót készítsünk. Mindegyik szuszpenzióhoz 1 ml vizes oldatot adunk (pH = 7,0), mely 20 mmó! l,2,4-trjazol-3- karboxamidot, az alábbi táblázatban felsorolt 20 mmól különböző ribóz donor egyiket és 25 mmót monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz. A reakciót 60 °C hőmérsékleten 24 óra alatt folytatjuk le. A reakció befejezése után a sejteket centrifugálással eltávolítjuk és a felső folyadékfázist analizáljuk. Ribavirin kitermelésére a kapott eredményeket a 3. táblázat mutatja. A ribavirin fizikai adatai azoposak az 1. példánál megadottakkal. 3. táblázat Ribóz donor Ribavirin kitermelés (%) inozin 75,66 5'-inozinsav 73,23 adenozin 59,30 5'-adenilsav 70,82 guanozin 76,15 5'-guanilsav 67,12 citidin 88,60 5'-citidilsav 77,83 uridin 85,19 5'-uridilsav 83,93 ribóz 29,02 ribóz-1-foszfát 30,84 3. példa 100-100 ml 2 %-os húsleves tápközeget az 1. példa szerinti mikroorganizmus-törzzsel beoltunk, majd rázással 28 °C hőmérsékleten 22 óra hosszat tenyésztjük, hogy mindegyikből mikrobás sejtek tenyészetét kapjuk, amelyeket centrifugálunk, az intakt sejteket elválasztjuk és ezután, a megfelelő módosított sejtek szuszpenziójának előállításához, mindegyiket a következők szerint kezeljük. I. Aceton hozzáadás-szárítás Intakt mikrobás sejtekhez 50 ml acetont adunk. majd a kapott elegyet 15 perc állás után centrifugáljuk. A centrifugált sejtekhez 50 ml acetont adunk és ezt a kezelést azonos módon megismételjük, majd vákuumban szárítjuk. A száraz mikrobás sejt-termékhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk. 2. Fogyasztás-olvasztás Intakt mikrobás sejteket egy éjjelen át -80 "C hőmérsékleten fagyasztjuk, majd másnap felmelegedni hagyjuk, és az olvadt termékhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk. 3. Ozmotikus kezdés Intakt mikrobás sejtekhez 100 ml telitett vizes nátrium-klorid oldatot adunk, és az elegyet egy éjjelen át jéghüléssel állni hagyjuk, majd másnap centrifugáljuk. A felső folyadékfázist döntjük, és az elválasztott mikrobás sejtekhez annyi vizet adunk, hogy 10 ml kezelt mikrobás sejtszuszpenziót kapjunk. 4. Ultrahangos kezelés Intakt mikrobás sejteket víz hozzáadásával 10 mire beállítjuk, és 20 percig 1,6 KV kapocsfeszültségen ultrahanggal kezeljük. Az előzőek szerint kezelt mikrobás sejtek mindegyik 10 ml-es szuszpenziójához, és az 1. példa eljárásával azonos módon kapott nem kezelt mikrobás sejtek 10 ml-cs szuszpenziójához 10-10 ml rcakeiószubsztrát-oldatot (pH = 7,0), melyek mindegyike 20 mmól l,2,4-triazol-3-karboxamidot, 20 mmól inozint és 25 mmól monokálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz. A reakciót 24 óra alatt 60 °C hőmérsékleten folytatjuk le. A ribavirin analízisével kapott eredményeket a 4. táblázat mutatja. A fizikai állandók azonosak az 1. példánál megadottakkal. 4. táblázat Enzimforrás, sejtek kezelése Ribavirin kitermelése {%) aceton hozzáadás-szárítás 72,31 fagyasztó-olvasztó kezelés 73,89 ozmotikus kezelés 71,50 ultrahangos kezelés 70,11 nem kezelt 68,12 4, példa Az 1. példa szerinti mikroorganizmus-törzset 25 ml 2 %-os húsleves táptalajba oltjuk, és rázással 28 °C 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
