191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
13 191 292 14 2. táblázat Rcakcióhőmérscklct CC) Maradék ribavirin (%) 60 100 50 100 45 100 37 92,80 28 90,14 Ezekből az eredményekből ipegállapítható, hogy ebben a megvalósítási formában a 45 “C, vagy ennél magasabb hőmérséklet az előnyös. A reakciószubsztrál-oldat általában 4-10 közötti pH-n, előnyösen 6-8 pH-n tartható. Ha reakció közben a pH változik, akkor valamely sav, mint sósav, kénsav, vagy foszforsav, vagy valamely alkália, mint nátrium-bidroxid, kálium-hidroxid, vizes ammónia, vagy ammóniagáz alkalmazható az előnyös pH-tartomány beállítására. Szakaszos rendszernél a reakcióidő, mely a kívánt termékre vonatkoztatva a reakciószubsztrátum átalakulásával határozható meg, általában 2-45 óra, előnyösen 24-36 óra. Folyamatos eljárásnál a reakció, a szakaszos rendszerhez hasonlóan, megfelelő körülmények beállításával folytatható le. Az enzimforrás szokásos eljárásokkal történő elválasztása, mint szűrése, centrifugálása vagy agglomerációs leválasztása után, kívánt esetben, a reakcióterméket elválasztjuk és a ribavifjnt tisztítjuk. A ribavirin elválasztása és tisztítása ismert módszerek szerint, vagy ezek módosításával folytatható le. Például, szokásos elválasztási/tisztítási módszerek alkalmazhatók, melyek önmagukban, vagy megfelelően kombinálva használhatók ; ilyenek a különböző kromatográfiás eljárások, beleértve az ioncserélő kromatográfiát, adszorpciós kroma.tpgráfiát, eloszlásos kromatográfiát, gélszűrést és hasonlókat, a két folyadékfázis közötti eloszlást alkalmazó módszer, mint az ellenáramú eloszlás, ellenáramú extrakció és hasonlók, vagy betöményítéssel, hűtéssel, szerves oldószer hozzáadásával és hasonlóval elért oldhatósági különbséget hasznosító módszerek. A jelen találmányban a ribavirin és az 1,2,4-triazol-3-karboxamid analízisét és azonosítását nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) végezzük. Ha az analízist az alábbiakban megadott műszerrel és körülmények között végezzük, akkor a ribavirin 3,50 perc körüli retenciós idővel, míg az l,2,4-triazol-3- karboxamid 2,65 perc körüli retenciós idővel eluálható, és a megfelelő mennyiségek kalibrációs görbékből kiszámíthatók. Műszer: Shitnadzu High Performance Liquid Chromatograph; Model LC- 3A (gyártja: Shimadzu Corporation). Oszlop: Micro-BONDAPAK, CI8, 4,6x250 mm (gyártja: Nippon Waters Limited). Eluálószer: 20 mmól trisz-spsav-pulTcr (pH = 7,5), 2 % acctonitrilt tartalmaz. Átfolyási sebesség: 1 inl/perc. Mérési hullámhossz: 225 nm. Oszlop működési hőmérséklete: szobahőmérséklet. A jelen találmányt a következő példákkal részletesebben mutatjuk be. I. példa Brevibacterium acetylicum AT —6 —7 mikroorganizmust porított húsleves (gyártja: Kyokuto Seiyaku Kogyo Co., Ltd.) 5 liter 2 %-os vizes oldatába oltjuk, és a rázótenyésztést 28 °C hőmérsékleten 24 óra hoszszat végezzük. ' A tenyésztés befejezése után a tenyészetet centrifugáljuk, mossuk és sterilizált vizet adunk hozzá, hogy 250 ml sejtszuszpenziót kapjunk. 750 ml 66,7 mmól !,2,4-triazo!-3-karboxainidot, 66,7 mmól inozint és 100 mmól monokálium-dihidrogcn-foszfátot tartalmazó vizes oldathoz hozzáadjuk az előbbi 250 ml sejtszuszpenziót, és a reakciót 60 °C hőmérsékleten 24 óra alatt elvégezzük (ribavirin kitermelése: 74,88 %). A ribavirin kitermelése az 1,2,4-triazol-3-karboxamid ribavirinné történő konverziójára (%} vonatkozik. A reakcióelegyet a mikrobás sejtek eltávolitására centrifugáljuk, majd kationcserélő gyantán (H+ forma) átengedjük, az átfolyt oldatot és a mosóvizet egyesítjük, és aktív szénnel töltött oszlopon átfolyatjuk. Az aktív szénről a ribavirint etanol-ammónia oldattal eluáljuk, és az eluátumot, az etanol eltávolítása után, anioncserclő gyantán átengedjük. Az átfolyt oldatot és a mosóvizet egyesítjük, csökkentett nyomáson 50 ml-re betöményítjük és lehűtjük. A lehűtött oldatból kristályos anyag válik ki, melyet szűrünk és szárítunk, igy 6,5 g kristályos ribavirint kapunk, op-ja 169,5-170 °C. A terméket az előzőekben leírlak szerint kromatografálva (HCLP), a kapott retenciós idő (3,5 perc) azonos a ribavirin standard retenciós idejével. Az NMR és ÍR vizsgálatok eredményei szintén megegyeznek a standard minták adataival. Összehasonlító példák Az 1. példa szerintivel azonos mikroorganizmustörzs alkalmazásával, ribavirin terrae lésére a kísérletet a kiindulási triazolvegyülct hozzáadásával, a mikroorganizmus szaporodó körülmények között, a 17 830/ 1979. számú japán szabadalmi leírás I. példájában leírt eljárás szerint folytattuk le. Részletesen: a mikroorganizmus-törzset 10 ml táptalajba oltjuk (pH - 7,6), melynek összetétele 530 g glükóz, 1 g monokáliumdihidrogén-foszfát, 3 g diká'ium-monohidrogén-foszfát, 1 g magnézium-szulfát, 0,1 g kaScium-kforid, Í0 mg vas(H)-szu!fát, 5 mg cink-szulfát, 10 mg mangánszulfát, 5 mg B, vitamin, 10 mg kalcium-paniotenát, 20 mg cisztin, 30 pg biotin, 10 g húsextrakt, 2 g ammónium-szulfát és 2 g karbamid (külön sterilizálva) 1 literben, és a tenyésztést rázás közben 28 °C hőmérsékleten folytatjuk le, miközben a pH-? minden 12 órában vizes ammóniával 7,2 pH-ra állítjuk be. A tenyésztés kezdete után 24 órával a tenyészethez 2 mg/ml koncentrációban 1,2,4-triszc!-3-karboxamj-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
