191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
11 191 292 12 Az érintkeztetés megfelelően választható meg az alkalmazott enzimforrás formájától függően. Rendszerint ehhez szakaszos rendszer alkalmazható, melyben az enzimforrást a re^kciószubsztrátum oldatában vagy szuszpendáljuk vagy oldjuk, és előnyösen melegítés közben keverjük vagy rázzuk, vagy a reakciószubsztrátumot adagoljuk az enzimforrás szuszpenziójába vagy oldatába, vagy folyamatos reakcióval, melyben az enzimforrást tetszés szerint erre alkalmas hordozóanyaggal vagy adszorbenssel keverjük, vagy ezen rögzítjük, és a reakciószubsztráturp-oldatot folyamatosan érintkeztetjük az enzimforrással. A rcakciószubsztrátum cs enzimforrás koncentrációját vagy mennyiségét a következők szerint jellemezzük. A reakció lefolytatásában, a reakcióelegyben, a szubsztrátum koncentrációja nem különösen korlátozott, azonban az adott hőmérsékleten, az alkalmazott vizes közeghez viszonyítva, általában a Szubsztrátum telített koncentrációja alatti szubsztrátjconcentrációt alkalmazunk, de lehetséges a szubsztrátkoncentráció növelése is a reakciószubsztrátum oldatához adagolt előbb említett oldószerektől, felületaktív szerektől és más anyagoktól függően. A szubsztráturpok a reakcióelegyben a telített koncentráció fölötti mennyiségben szuszpendált állapotban is lehetnek, melyben az illető szubsztrátumok a reakció előrehaladásával oldódnak. A szubsztrátumok reakció közben folytonosan is adagolhatok a reakcióelegyhez, hogy ezek koncentrációját megfelelő szinten tartsuk. Ha a szubsztrátum oldódik, akkor az 1,2,4-triazol-3-karboxamidra vagy sójára a szubsztrátkoncentráció általában mintegy 5-200 mmól, előnyösen 10-100 mmól. Ribóz donorra, ha külön adjuk a reakcióelegyhez, a koncentráció általában mintegy 5-300 mmól, előnyösen 10-150 mmól. Az alkalmazandó enzimforrás mennyiségét a szakember például előzetes kísérletekkel könnyen meg tudja határozni, figyelembe véve az alkalmazott enzimforrás formáját, a reakció hatékonyságát, valamint a gazdaságosságot. Ezek szerint, szakaszos rendszer esetén, például intakt (nedves) mikrobás sejtek alkalmazásánál a mennyiség 10 — 150 mg/ml szubsztxi 'oldatra, vagy száraz mikrobás sejtek esetén 2-30 mg/ml szubsztrátoldatra számítva. Folyamatos reakciórendszerben a megfelelő mennyiség a szakaszos rendszerhez hasonló lehet. A reakció körülményei nem különösen korlátozottak, kivéve azt, hogy az enzimforrást a reakció nem szaporodó körülményei között alkalmazzuk, vagyis olyan feltételek mellett, ahol a mikrobás sejtek nem működnek vagy elpusztultak. Ahhoz, hogy azcnzimforrásnál a mikroorganizmus nem szaporodó körülményeit biztosítsuk, különböző módszereket alkalmazhatunk. Ilyenek például- az enzimatikus reakciót olyan hőmérsékleten végezzük, amelyen az alkalmazott mikroorganizmus nem szaporodik (feltéve, hogy ezen a hőmérsékleten a reakcióban résztvevő enzim nem dezaktiválódik), vagy — .a mikroorganizmus sejteket az e|őzőekben leírt valamely fizikai, kémiai vagy biokémiai kezeléssel nem-szaporodóvá tesszük, vagy- valamely, a szaporodást gátló anyag, például toluol adagolásával akadályozzuk meg a mikroorganizmusok szaporodását. Ezek a módszerek különkülön vagy egymással kombinálva is alkalmazhatók, de legelőnyösebb a reakcióhőmérséklet megfelelő beállítása. A jelen találmány szerinti reakcióban a rcakcióhömérséklet fontos tényező, mint azt az előzőekben leírtuk. Bár a reakció 37 - 80 °C közötti hőmérsékleten végbemehet, azonban a 40- 70 °C közötti hőmérséklet különösen előnyös. Az optimális hőmérsékleti körülményeket, mely az alkalmazott rcakciószubsztrátumlól függően változik, egy szakember előzetes kísérletekkel vagy más módon, egyszerűen meg tudja határozni. Az enzimatikus reakció 40 °C fölött történő lefolytatásával a mikroorganizmus szaporodása könnyen gátolható. Például l,2,4-triazol-3-karboxamidból a ribavirin kitermelése és a reakció után az alkalmazott mikroorganizmus százalékos túlélése közötti viszonyt - ha az I. példában használt azonos mikroorganizmus intakt sejtjeit alkalmazzuk, mint ahogy a későbbiekben leírjuk, és a reakciót 28 - 60 °C között különböző hőmérsékleteken folytatjuk le - az alábbi 1. táblázat mutatja. A mikroorganizmus túlélési százalékát a túlélő mikroorganizmus-populáció/ml reakció utáni százalékos értékében adjuk meg a reakció kezdete előtti értékre vonatkoztatva. /. táblázat Reakció-Ribavirin A mikrohőmérséklet kitermelés organizmus túlélési (■C) (%) százaléka (%) 60 75,25 0 50 71,82 0 45 55,95 0,19 37 28,01 2,13 28 0 91,30 Mint ahogy már leírtuk, a találmány szerinti reakciót az alkalmazott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között kell lefolytatni, mégpedig olyan körülmények között, ahol az alkalmazott mikroorganizmus sejtjeinek többsége nyugvó állapotban van, vagy elpusztult. Továbbá, a jelen találmányban, a rcakcióhőmérséklet előzőekben meghatározott tartományban való tartása nem csak a ribavirint termelő enzimatikus reakció sebességét növeli, hanem kísérletileg bizonyítva, a képződött ribavirin bomlási reakcióját is visszaszorítja. Példaként, a 2. táblázat a ribavirin maradék százalékát (%) mutatja, ha 1 ml 20 mmól ribavirint tartalmazó oldathoz az 1. példában alkalmazott mikroorganizmus intakt sejtjeinek 1 ml szuszpenzióját adjuk, és ezután 28-60 °C közötti hőmérsékleten 20 óra hosszat inkubáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
