191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
9 191 792 10 olvasztó kezelés, lioíílizálás, légszárítás, acetonos szárítás, savas vagy alkálikus körülmények közötti melegítés, őrlés, ultrahangos kezelés, ozmotikus kezelés és hasonló, vagy kémiai vagy biokémiai kezelés, mint enzimes kezelés zizozimmal, enzimek sejtfal oldása stb., kontakt kezelés oldószerekkel, mint toluollal, xilollal, butil-alkohollal vagy felületaktív szerekkel; (2) Mikrobás sejtek cxtraktumán egyszerű vagy kombinált enzimelválasztás és tisztítás alkalmazása, mint amilyen a kisózás, izoelektromos ponton történő lecsapás, szerves oldószerekkel való lecsapás, különböző kromatográfiás kezelés, dialízis és mások ; vagy (3) Intakt mikrobás sejtek, mikrobás sejtextraktumok vagy ezek tisztított termékeinek rögzítése, mint sejtzárvány készítése, térhálósító kezelés, adszorpciós kezelés hordozóanyagra és hasonlók. A találmány szerinti enzimatikus reakcióban reakciószubsztrátum az !,2,4-triazoi~3-karboxamid és a ribóz donor. Az l,2,4-triazo!-3-karboxamidot lehetséges szabad vagy só formában, mint nátriumsó formában alkalmazni. A jelen találmányban a ribóz donor egy ribóz származékot jelent, mely a találmány szerint alkalmazott mikroorganizmus enzimforrásának hatására a D- ribóz-maradék l,2,4-triazol-3-karboxamidra történő átvitelre képes, és magában foglalja azokat az anyagokat, amelyeket külön adagolunk és azokat is, amelyeket az enzimforrásként használt mikroorganizmus sejtjei már mint sejten belüli komponenseket tartalmazzák; ezek vagy a jelen találmány szerinti reakcióban résztvevő enzim reakciószubsztrátumai lehetnek, vagy a jelen találmány reakciókörülményei között mint prekurzor anyagok, az előbbi reakció szubsztrátumává alakulhatnak. Ilyen anyagokként különböző ribonukleozidok, vagy a D-ribóz, vagy ezek különböző foszforészterei emlithetök meg. A jelen találmány felöleli az alkalmazott enzimforrásban jelenlevő, vagy az enzimatikus reakcióban „in situ” képződött ribóz donor hasznosítását, de egy előnyös megvalósítási forma magába foglalja a reakciórendszerhez külön hozzóftdott ribóz donor használatát is. A ribóz donor, mint ahogy az előzőekben leírtuk, bármilyen ribonukleozid, vagy D-ribóz, vagy ezek különböző foszforészterei lehetnek. Másszóval, lehetséges bármilyen ribonukleozid alkalmazása, melynek egyik alkotórésze vagy purin-típus, vagy pirimidintípus, függetlenül attól, hogy ez a ribonukleozid egy természetben előforduló termék, vagy kémiai szintézisből származik. A ribonukleozidok vagy a D-ribóz foszfátjai monofoszfát, difoszfát vagy trifoszfál részt tartalmaznak a 2-, 3- és 5-hclyzcl bármelyik egy, két vagy mindegyik helyzetén. Ezek a foszfátok vagy szabad formában, vagy szokásos alkálisók formájában, mint nátrium, kálium, kalcium, magnézium, ammonium, trietil-ammóníum és hasonló sók formájában lehetnek. A ribóz donor jellemző példái magukba foglalják a ribonukleozidokat, ilyen az inozin, adenozin, guanozin, xantozin, uridin és á citidin; a ribonukleotidokat, ilyen az 5'-ionozinsav, 5'-adeni!sav, 5'-guanilsav, 5'xantilsav, 5'-uridilsav, 5'-citidilsav, 2'(3')-inozinsav, 2'(3/)-adenilsav, 2'(3')-guanilsav, 2'(3')-xantilsav, 2'(3')-uridilsav, és a 2'(3')-citidilsav; továbbá a D-ribóz, D-ribóz-1-foszfát és hasonlók. A jelen találmány szerinti enzimatikus reakcióhoz használt reakciószubsztrátum oldat alapjában egy vizes folyadék, mely az előbb említet reakciószubsztrátumot vizes közegben oldva vagy szuszpendálva tartalmazza. A vizes folyadék, az előbb említett reakciószubsztrátumon túlmenően, tetszés szerint az enzimatikus reakció serkentéséhez, a reakciószubsztrátum oldhatóságának javításához, vagy az enzim és a rcakciószubsztrátuin közötti érintkeztetés elősegítéséhez különböző anyagokat tartalmazhat, mint amilyenek a foszfátion donorok, a szerves oldószerek, a felületaktív anyagok. Icmsók. koenzimek, savak, bázisok, cukrok és hasonlók. Az enzimatikus reakciókhoz vizes közeg, előnyösen a víz, vagy különböző puffer lehet [például foszfátpuífer, imidazoI-(hídrogén-klorid)-pufTer, veronál(hidrogén-klorid)-puffer, trisz-(hidrogén-klorid)pufTcr], mely foszfáliont átadó forrást, és kívánt esetben különböző anyagokat is tartalmazhat. A jelen találmány szerinti enzimatikus reakciót főleg nuklcozid-foszforilázzal katalizáljuk, ezért a reakcióközegben a foszfáton jelenléte szükséges. Következésképpen, ha a közeg foszfátiont nem tartalmaz, akkor az enzimatikus reakcióközeghez foszfátiont átadó anyagot kell hozzáadni. Foszfátiont átadó anyagok közül bármelyik, vizes közegben foszfátionra disszociálható vegyület alkalmazható, mint amilyen maga a foszforsav, szervetlen foszfátok, mint az alkálifémsók, például a nátrium, kálium és hasonlók; az alkáliföldfémsók, például a kalcium, magnézium és hasonlók; vagy az ammóniumsók. Ugyancsak, foszfátiont átadó anyagok közül olyan rendszer is használható, mely az enzimreakció oldatában foszfátionok felszabadítására képes, mint amilyen a különböző foszforészterek alkalmazása foszfatázokkal kombinálva, és a ribonukleotidok nukleotidázokkal kombinálva. Az ilyen rendszerben az enzimeket, jelen találmányban alkalmazott enzimforrás tartalmazza, vagy az ilyen enzimatikus aktivitással rendelkező más enzimek, mikrobás sejtek vagy módosított mikrobás sejtek, külön is hozzáadhatok a reakcióközeghez. Az ilyen foszfát átadó rendszer a reakció közben vagy külön, vagy az alkalmazott enzímforrás komponenseként adható a rendszerhez. Vagyis, amennyiben az előbbi anyagok az enzimatikus reakció szempontjából hasznosítható formában vannak, akkor vagy egyedül, vagy két vagy több anyag kombinációjából álló rendszer, vagy a fenti anyagokat tartalmazó mikrobás sejtek, vagy módosított sejtjeinek formájában külön adhatók a reakciórendszerhez az enzimatikus reakció közben, vagy más változat szerint, az alkalmazott mikroorganizmusban sejtkomponensként ilyen alkotórészeket tartalmazó anyagok is hozzáadhatok. Szerves oldószerként használható például a metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, aceton, metil-etil-keton, etil-acetát, toluol, tetrahidrofuráo, dioxán, dimetil-szulfoxid, dimeíil-acetamid, dimetilformamid, 2-mctoxi-etanol, 2-etoxi-etanol, és az 1,2- dimetoxi-etán. A jelen találmány szerinti reakció az előbb megadott enzimforrás és a reakciószubsztrátum érintkeztetésével vizes közegben, az adott mikroorganizmus nem szaporodó körülményei között végezhető el. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
