191292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ribavirin előállítására
7 191 292 8 2-án ATCC 39 311 letéti szám alatt az ATCC közvetlenül megkérte. Az előzőekben felsorolt különböző mikroorganizmus-törzsek közül előnyösek azok, melyek 50 %, vagy ennél magasabb ribavirin-termelésre képesek. Ilyen mikroorganizmusok a következők: Brevibacterium acetylicum AT-6-7: FERM P —6305 (ATCC 39 311) Flavobacterium lutescens: IFO 3084 (ATCC 25 311) Xanthomonas oryzae: IFO 3312 Pseudomonas putrefaciens : ATCC 8072 Achromobacter xerosis: IFO 12 668 Escherichia coli: 1AM 1268 (ATCC 11 303) Cellulomonas flavigena: IFO 12 680 (ATCC 486) Ezek közül a Brevibacterium acetylicum AT -6 — 7 a legelőnyösebb. Az enzimforrás előállításánál ezen mikroorganizmusok tenyésztésében a tenyészközeg és az alkalmazott tenyésztés módszere nem különösen korlázozott, amennyiben a tenyésztés ezen mikroorganizmusok fejlődését lehetővé teszik. Tenyészközegként megfelelő mennyiségű szénforrást, és ezen mikroorganizmusok által asszimilálható nitrogénforrást tartalmazó táptalaj alkalmazható, melyhez tetszés szerint szervetlen sók, fejlődést elősegítő anyagok, habzásgátló szerek és hasonlók adhatók. Pontosabban meghatározva, szénfogrások közül kiválasztható egy vagy több anyag, megfelelően tekintetbe véve azt, hogy ez az alkalmazott mikroorganizmus által asszimilálható legyen: ilyenek a cukrok, például a glükóz, fruktóz, maltóz, galaktóz, ribóz, szacharóz, keményítő, keményítőhidrolizátum, melasz, hulladékmelasz és hasonlók, vagy ezek származékai, mint zsírsav-észterei; természetes szénhidrátok, mint búza, búzakorpa, rizs és hasonlók; alkoholok, mint glicerin, mannit, metanol, etanol és hasonlók; zsírsavak, mint glükonsav, piroszőlősav, ecetsav, citromsav és hasonlók; szénhidrogének, ...int normál paraffinok, kerozin és hasonlók; aminosavak, mint glicin, glutaminsav, gluf-min, alanin, aszparagin és hasonlók. Nitrogénforrások közül kiválasztható egy vagy többféle anyag, megfelelően tekintetbe véve azt, hogy ez az alkalmazott mikroorganizmus által asszimilálható legyen: ilyenek a szerves nitrogéntartalmú anyagok, például a húsextrakt (húsleves), élesztőextrakt, szárított élesztő, szójabi..y-hidrolizátum, szójababpor, tejkazein, kazaminsav, különböző aminosavak, kukoricalekvár, gyapotmagliszt vagy hidrolizátuma, halliszt vagy hidrolizátuma, más állati, növényi anyagok, mikroorganizmusok stb. hidrolizátumai, szervetlen nitrogénvegyületek, mint az ammónia, ammóniumsók, például ammónium-nitrát, ammóniumszulfát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát, ammónium-karbonát, ammónium-acetát és hasonlók, nitrátok, mint a nátrium-nitrát, karbamjd és hasonlók. Továbbá, szervetlen sóként csekély mennyiségben megfelelően egy vagy több só is hozzáadható, mint amilyen a magnézium, mangán, vas, cink, réz, nátrium, kalcium, kálium stb. foszfát, klorid, szulfát, karbonát, nitrát, acélát és más sói. Szükség esetén a tenyészközeghez habzásgátló szer, mint növényi olaj vagy felületaktív anyag, csekély mennyiségű fejlődést elősegítő anyag, mint Bl, B2 vitaminok, nikotinsav, pantoténsav, biotin, p-amino-benzoe-sav és hasonló is hozzáadható. Ha egy olyan mikroorganizmust alkalmazunk, amelynek további tápanyag igénye van, akkor ezeket a növekedéshez szükséges anyagokat is a tenyészközeghez adagoljuk. A tenyésztés folyékony közegben folytatható le, mely az előbb megadott komponenseket tartalmazza, kiválasztva a szokásos tenyésztési módszerek közül az alkalmazott mikroorganizmusnak megfelelő tenyésztési módszert, mint ameilyen a rázótenyészlés, levegőztetett kevert tenyésztés, állótenyésztés, folyamatos tenyésztés és inasok. A tenyésztés körülményei az alkalmazott mikroorganizmustól és a tenyészközegtől függően választhatók meg, azonban a tenyésztés megkezdése előtt általában a pH-t 6-8 értekre állítjuk be, es a tenyésztést 25—35 °C közötti hőmérsékleten folytatjuk le. A tenyésztés ideje az alkalmazott mikroorganizmus szaporodásához szükséges időtartam általában 1 - 3 nap. A jelen találmányban alkalmazott enzimforrás egy olyan enzimet tartalmaz, mely a ribavirin termeléséhez az l,2,4-triazol-3-karboxamid ribóz donorral való reakcióját katalizálja A jelen találmány szerint az enzimatikus reakcióban feltétlenül szükséges enzim főleg nukleozid-foszforiláz, így a találmány szerint alkalmazott enzimforrásnak elsősorban ilyen enzimatikus antivitással kell rendelkeznie. Ezen túlmenően, amikor egy olyan vegyületet alkalmazunk ribóz donorként, mely közvetlenül nem képes a nukleozidfoszforiláz szubsztrátuma lenni, akkor az enzimforrásnak legyen olyan enzimatikus aktivitása, mely a ribóz donort az enzim szubsztrátumává alakítja. A ribózdonor elengedhetetlen, de ebben a megvalósítási formában nem szükséges külön az enzimatikus reakciórendszerhez adagolni, mivel az enzimforrás kell, hogy tartalmazzon vagy egy ribóz donort, vagy egy olyan metabolizinust, amely ribóz donor termelésére képes. A tenyésztés után a mikroorganizmus, mint ahogy az előbbiekben leírtuk, a tenyészet, a mikroorganizmus intakt sejtjei — melyet a tenyészetből szokásos módszerrel, mint ccntrifugálással, iilcpítcscs elválasztással, agglomerációs elválasztással különítünk el — vagy a mikroorganizmus módosított sejtjei — melyet az intakt sejtek megfelelő kezelésével kapunk - a jelen találmányban enzimforrásként alkalmazhatók. A „tenyészet" kifejezés itt a termék olyan állapotára vonatkozik, ahol a táptalaj és a tenyésztett mikrobás sejtek a tenyésztés után még nincsenek egymástól elválasztva. A mikroorganizmus „módosított sejtjei” kifejezés száraz mikrobás sejtekre, denaturált sejtmembránnal és/vagy sejtfallal rendelkező mikrobás sejtekre, préselt mikrobás sejtekre, rögzített mikrobás sejtekre, mikrobás sejtextraktumra, a találmány szerinti ribavirin termelésében résztvevő enzimaktivitással rendelkező mikrobás sejtextraktum protcinfrakciójára, vagy ennek tisztított termékére, továbbá, a proteinfrakciók rögzített termékére, vagy ennek tisztított termékére, és hasonlókra vonatkozik. A mikrobás sejtek módosításának módszerét a következők szemléltetik. Vagyis, módosított mikrobás sejtek a következő módszerekkel állíthatók elő: (1) Intakt mikrobás sejteken egyszerű vagy kombinált fizikai kezelés alkalmazása, ilyen a fagyasztó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
