191202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
3 191202 4 2,5-Diketo-D-glükonsavat termelő 1. táblázat mikroorganizmus [(I) törzs]. FERM-P ATCC Erwinia citreus 5449 31623 Erwinia punctata 5452 31626 Erwinia punctata var. 5450 31624 Erwinia punctata var. 5451 31625 Erwinia punctata var. 5453 31627 Erwinia terreus 5454 31628 Erwinia terreus var. 5455 31629 Erwinia terreus var. 5456 31630 Erwinia terreus var. 5457 31631 2. táblázat 2-Keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus [(11) törzs]. Brevibacterium ketosoredictum FERM-P ATCC nov. sp. 1905 21914 Brevibacterium nov. sp. 2686 31083 Brevibacterium sp. Brevibacterium testaceum 2685 31082 IFO 12675 — — Corynebacterium sp. 2687 31081 Corynebacterium sp. 2771 31089 Corynebacterium sp. 2769 31088 Corynebacterium sp. 2770 31090 Ezeket a mikroorganizmusokat a feltalálók letétbe helyezték a Fermentation Research Institute, Yatabe, Japán intézménynél mint FERM-P törzseket és az American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A. intézménynél mint ATCC törzseket, és ezek mintái ezekről a letéti helyekről hozzáférhetők a Budapesti Egyezmény rendelkezései szerint. A mikroorganizmusok részletes rendszertani leírásai a 0 046 284 sz. nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben vagy a 3,922,194. sz., 3,959,076. sz. vagy a 3,963,574. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban találhatók meg. Az egyik IFO-számmai jelzett mikroorganizmus az Institute of Fermentation, Osaka, Japán inzétménytől is beszerezhető, és a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 8. kiadásában írják le. A fent leírt (I) és (II) törzsekből ultraibolya besugárzással vagy X-sugárral vagy vegyszeres kezeléssel előidézett mutációval kapott mutáns hasonlóképpen alkalmazható a jelen találmány megvalósításához. A jelen találmányban semmiféle különleges megkötés nincs az (I) és (II) törzsek tenyésztésére használt táptalaj összetételére, ámbár kívánatos tartalmaznia szénforrásokat, más szervetlen sókat és egyéb olyan faktorokat nyomokban, amelyeket a törzsek asszimilálni képesek. Bár szénforrásként főként D-glükózt, a kiindulási szubsztrát anyagot használjuk, bármely hagyományosan alkalmazott szénforrás, például szacharóz, glicerin, melasz és hasonló is használható. Nitrogénforrásként kukoricalekvár, pepton, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, szójaliszt, gabonasikér vagy egyéb nitorgénvegyületek, például karbamid és hasonlók említhetők. Szervetlen sókként kalciumsók, magnéziumsók. káliumsók, cinksók, vassók, és a növekedés szempontjából esszenciális más fémek sói alkalmazhatók. Továbbá szükség esetén a mikroorganizmusok növekedését és a végtermék termelését fokozó faktorok is adhatók a táptalajhoz. Ezen különböző tápanyagok és faktorok keverési aránya az alkalmazott törzsek jellegétől, az inokulálás előbb leírt módjától, a használt D-glükóz szubsztrát mennyiségétől és a fennálló körülményektől függően változik, és ennélfogva az illető esetek ezen körülményeinek figyelembevételével alkalmasan megválasztandó és meghatározandó. Bár a D-glükóz szubsztrát koncentrációja a fermentlében a törzs fajától függően változhat, általában 10-300 g/liter az alkalmazott koncentráció. A tenyésztési körülmények a törzs fajától, a táptalaj összetételétől, a két törzs inokulálásának előbb leírt módjától, a két törzs inokulum-méreteinek arányától, az inokulálás idejétől és egyéb körülményektől függően változhatnak, bár általában ajánlatos a tenyészet hőmérsékletét 20—35 °C-on és a táptalaj pH-ját 4—9-en tartani. Ebből a célból valamilyen alkalmas savas vagy bázisos anyag adható a táptalajhoz alkalmas időben a tenyésztés alatt, vagy valamilyen pufferáló ágens lehet jelen alkalmas mennyiségben már kezdettől fogva a kiindulási táptalajban. A tenyésztési idő általában 10-100 óra. Az (I) törzs tenyésztésével termelt 2,5-diketo-glükonsavat a (II) törzs közvetlenül átalakítja 2-keto-L-gulonsavvá anélkül, hogy elkülönítenénk a táptalajtól. A (II) törzs által termelt nem kívánt 2-keto-D-glükonsavat az (1) törzs 2,5-diketo-D-glükonsawá alakítja, amelyet a (II) törzs ismét 2-keto-L-gulonsawá alakít át. Az így termelt és a tenyészközegben felhalmozódott 2-keto-L-gulonsav elkülöníthető a táptalajból és szokásos módon tisztítható. A találmány szerinti eljárásban nyert 2-keto-L-gulonsav azonosítása elemanalízissel és a fiziko-kémiai tulajdonságok, például olvadáspont, infravörös abszorpciós spektrum, optikai forgatás és hasonlók mérésével történhet. Amint fentebb leírtuk, a jelen találmánynak a 2-keto-L-gulonsav termelésben a következő előnyei vannak: a) először, egy eljárási lépcsőben állít elő 2-keto-L-gulonsavat D-glükózból; b) másodszor, kiküszöböli az intermedier elkülönítésének szükségességét; c) harmadszor, nincs nem kívánt izomer egyidejű termelése és az előnyök kiváló eredményeket adnak ipari méretű alkalmazáskor is. A következő leírásban a jelen találmányt példák útján részletesebben elmagyarázzuk, az összetételekben a százalékok súly/térfogat százalékokat jelentenek. 1. példa: 1.2,5-Diketo-D-glükonsav előállítása az (I) törzzsel. Ebben a példában mikroorganizmusként Erwinia punctata FERM-P 5452-t használunk. (i) Oltó táptalaj: 1.0 % D-glükózt, 5.0 % kukoricalekvárt, 0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,02 7c magnézium-szulfát heptahidrátot és 0,5 7c kalcium-karbonátot tartalmazó vizes oldat pH-ját 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 6.8-7,0-re állítjuk, és 50 ml-es részleteket töltünk belőle 500 ml-es kúpos palackokba, amelyeket utána 120 °C-on 20 percig sterilizálunk. 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
