191202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
5 191202 6 i (ii) Oltó tenyészet: A fenti palackban lévő oltó táptalajt egy kacsnyi FERM-P 5452-vel (3. táblázat) oltjuk be, és 28 °C-on rázás közben (71 mm amplitúdó, 270 ford/perc) 8-11 órát inkubáljuk. Mikor a tenyészet optikai sűrűsége (O.D.) körülbelül 8 lesz, az oltó tenyésztést leállítjuk (végpont). (iii) Fermentációs táptalaj: 20 % D-glükózt, 3 % kukoricalekvárt, 0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot, 6,3 % kalcium-karbonátot és 0,01 % polipropilén-glíkol 2000-t (P-2000) tartalmazó vizes oldat pH-iát az előbb leírtak szerint 6,8-7,0-re állítjuk, és 120 “T-on 20 percig sterilizáljuk. 455 ml-es adagokat öntünk belőle 1 literes fermentorba, és 45 ml fenti oltó tenyészettel inokuláljuk. (iv) A fermentáció körülményei: Hőmérséklet: 28 °C Keverés: 1740 ford/perc Levegőztetés: 600 normál ml/perc Idő: 17—31 óra (v) Analízis: A fermentlében lévő termékeket felszálló papírkromatográfiával analizáljuk az alább felsorolt részletek szerint, és kvantitatíve denzitometriával határozzk meg. (a) Hordozó: Toyo Roshi No. 50; beszerezhető a Toyo Roshi K.K.-tól. (b) Kifejleszthető oldószer: fenol: hangyasav: víz = = 75:4:25. (c) Előhívó színreagens: anilin-hidrogén-ftalát (AHF) oldat. (Elkészítése: 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat oldunk 100 ml vízzel telített n-butanolban.) A bepermetezett kromatogramot 105 °C-on 2 percig melegítjük. Ezenkívül párhuzamosan vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatot végeztünk „TLC alumisheet celluse”-on (a Merck A.G.-tól beszerezhető, alumínium-fólia hordozón lévő cellulózréteg) a fent leírt kifejlesztő oldószerrel és színhívó reagenssel. Ebben az esetben azonban a kvantitatív meghatározást autentikus mintával való öszszehasonlítással végeztük. (vi) Végpont: A fermentációt akkor fejezzük be, amikor a 2-keto-D-glükonsav piros foltja eltűnik a fent leírt rétegkromatogramról. 2. 2,5-Diketo-glükonsav oldatok készítése: A kevert tenyészet előnyeinek bizonyítása céljából a következő háromféle 2,5-diketo-D-glükonsavat tartalmazó oldatot készítünk el: (i) Az (1) törzs által az 1. pont (iv) rész körülményei között előállított 2,5-diketo-D-glükonsavat tartalmazó fermentlevet körülbelül négyszeresére hígítjuk sterilizált vízzel [így 108 — 1010 (1) törzshöz tartozó élő sejtet tartalmaz milliméterenként]. 4 (ii) Az (i) oldatot centrifugáljuk és szűréssel sterilezzük (kontroll 1). (iii) 5 % kalcium-2,5-diketo-D-glükonátot tartalmazó vizes oldatot szűréssel sterilezőnk (kontroll 2). 3. 2-Keto-L-gulonsav előállítása 2,5-diketo-D-glükonsavból a (II) törzzsel. (i) Oltó táptalaj: 1 % D-glükózt, 0,5 % Bacto élesztő extraktumot (Difco), 0,5 % Bacto peptont (Difco), 0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,02 % magnézium-szulfát-heptahidrátot tartalmazó vizes oldat pH-ját 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 7,0-7,2-re állítjuk, és ennek 50 ml-es részleteit 500 ml-es kúpos palackokba töltjük, amelyeket utána 115 C-on 15 percig sterilizálunk. (ii) Oltó tenyészet: A fenti palackokban lévő (i) oltó táptalaj minden egyes részletét egy kacsnyi 2. táblázatban felsorolt valamely (II) törzzsel inokuláljuk, és 28 °C-on 16—24 órát inkubáljuk rázás közben (71 mm amplitúdó, 270 ford/perc). (iii) Fermentációs táptalaj: 1.0 % D-glükózt, 3.0 % kukoricalekvárt, 0,1 % kálium-dihidrogén-foszfátot és 0,02 % magnézium-szulfát-heptahidrátot tartalmazó vizes oldat pH-ját 10%-os nátrium-hidroxid oldattal 7,0-7,2-re állítjuk, és ennek 50-50 ml-es részleteit 500 ml-es kúpos palackokba töltjük, amelyeket utána 115 °C-on 20 percig sterilizálunk. (iv) Fermentáció: A (II) törzs oltótenyészetének 5-5 ml-ét inokuláljuk a palackokban lévő fenti fermentációs táptalaj mindegyikébe. Az előző 2. pont (i), (ii) és (iii) részében készített 2.5- diketo-D-glükonsav oldatokat egyenként hozzáadjuk a fermentációs táptalajhoz a fermentáció kezdetén vagy 16 órával a fermentáció kezdete után [rázás: 71 mm aplítúdó, 270 ford/perc 28 °C-ort] úgy, hogy 2,5 %-os 2.5- diketo-D-glükonsav koncentrációt kapjunk. Az (i) 2.5- diketo-D-glukonsav fermentlé az (I) törzs élő sejtjeit tartalmazza. Ezután a tenyésztéseket további 48 óráig folytatjuk. (v) Kvantitatív analízis: Gáz-folyadék kromatográfia. (Oszlop: SE 52,5 %; Minta: trimetilszililezett; Hőmérséklet: 160-210 °C; Vivőgáz: hélium.) A fermentáció eredményeit a 3. és 4. táblázatban öszszegezzük: Amint a táblázatokban látható, az (1) és (11) törzsek kevert tenyészetének esetében nem volt megfigyelhető 2-keto-D-glükonsav egyidejű termelése, míg a 2-keto-D- glükonsav termelése a 2-keto-L-guIonsav felhalmozódásával megfigyelhető volt a (II) törzs tiszta tenyészetének mindkét esetében a kontroll csoportokban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
