191202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására
1 191202 o A jelen talámány 2-keto-L-gulonsav közvetlenül D-glükózbói való mikrobiológiai előállítási eljárására vonatkozik, amelyben kétfajta mikroorganizmus kevert tenyészetével egy fermentorban termeljük a 2-keto-L-gulonsavat, amely felhalmozódik, és utána kinyerjük a fermentorból. A feltalálók, akik 2-keto-L-gulonsav mikrobiális előállításának tanulmányozásával foglalkoztak, különböző mikroorganizmusokat találtak, amelyek 2-keto-L-gulonsav 2,5-diketo-D-glükonsavból való termelésére képesek, és bejelentettek eljárásokat 2-keto-L-gulonsav vagy sóinak előállítására 2,5-diketo-D-glükonsav mikrobiális átalakításával, amelyet D-glükóz oxidativ fermentálásával nyernek. [Lásd például a 3,922,194 (RE 30,872), 3,959,076 és 3,963,574 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat]. Jól ismert, hogy 2,5-diketo-D-glükonsav, a 2-keto-L-gulonsav prekurzora ezen bejelentések szerinti eljárásokban, D-glükózból magas kitermeléssel nyerhető olyan mikroorganizmus oxidativ hatására, amely a Gluconobacter nemzetséghez tartozik (a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadásában megadott meghatározás szerint; a Gluconobacter nemzetséghez eszerint az Acetobacter, Acetomonas és Gluconobacter nemek tartoznak a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 7. kiadásában leírtak szerint). Másrészt a feltalálók felfedezték, hogy az Ervinia nemzetséghez tartozó bizonyos mikroorganizmusok magas kitermeléssel hatásosan termelnek 2,5-diketo-D-glükonsavat D-glükózból (lásd például a 0 046 284 sz. nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentést). Ettől eltekintve a feltalálók előzőleg a következő tényeket állapították meg (lásd például 3,998,697 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést): (a) Még ha 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmust és 2-keto-L-glukonsavat termelő mikroorganizmust is hagyunk együtt működni a fermentációs elegyben, a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő törzs által előállított 2,5-diketo-D-glükonsav nehézség nélkül simán átalakítható 2-keto-L-gulonsavvá. (b) Ha a 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmus és a 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus együtt van jelen a tenyészetben, nem kívánt optikai izomer, 2-keto-D-glükonsav, amelyet másképp termel a 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmus, nem halmozódik fel a tenyészetben. (c) A fő ok arra, hogy 2-keto-D-glükonsav nem halmozódik fel a tenyészetben az, hogy a 2-keto-L-gulonsavat termelő törzs által egyzser termelt 2-keto-D-glükonsavat ismét visszaalakítja 2,5-diketo-D-glükonsavvá a 2,5- -diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmus, és a 2,5-dikekto-D-glükonsav utána 2-keto-L-gulonsawá alakul át. Az előbb említett bejelentésben (3,998,697. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) a feltalálók közölték, hogy olyan mikroorganizmus amely a Gluconbacter nemzetséghez tartozik, használható 2,5-diketo-D-glükonsavat termelő mikroorganizmusként, mig olyan mikroorganizmus, amely a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozik, használható 2-keto-L-gulonsavat termelő mikroorganizmusként, és az ezt kísérő 2-keto-D-glükonsav-termelés a két mikroorganizmus kombinált alkalmazásával küszöbölhető ki. Azonban egy Erwinia nemzetséghez tartozó mikroorganizmusnak egy Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozó mokroorganizmussal való kombinációjának és összeférhetőségének a hatását eddig még nem állapították meg. A jelen találmány tárgya ezért az, hogy bizonyítsa, hogy egy Erwinia nemzetséghez tartozó mikroorganizmus összeférhető egy Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez tartozóval egy 2-keto-L-gulonsav előállítására szolgáló olyan eljárásban, amely jobb eredményeket szolgáltat, mint a szakterületen az illető termék előállítására eddig leírtak. A jelen találmány szerint 2-keto-L-gulonsav vagy valamilyen sójának D-glükózból való előállítására szolgáló eljárásban 2,5-diketo-D-glükonsav D-glükózból való előállítására képes mikroorganizmus (1) és 2,5-diketo-D-glükonsav 2-keto-L-gulonsavvá való átalakítására képes második mikroorganizmus (2) vegyes tenyészetét használjuk D-glükózt tartalmazó táptalajban, amelyben egyidejűleg mindkét említett mikroorganizmus jelen van, és az eljárásra az jellemző, hogy az említett első mikroorganizmus az Erwinia nemzetséghez tartozik,és az említett második mikroorganizmus a Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetséghez. A közölt eljárásban a mikroorganizmusok tenyésztése D-glükózt tartalmazó táptalajban történik. A 2-keto-D-glükonsav, a kívánt termék nemkívánt izomerének egyidejű keletkezését hatásosan gátolja a kevert tenyésztés alkalmazása a két mikroorganizmusnak a táptalajban a teljes tenyésztés legalább egy része alatt való együttléte miatt. A második mikroorganizmus által termelt 2-keto-D-glükonsavat ugyanis az első mikroorganizmus felhasználja 2,5-diketo-D-glükonsav termelésére, amelyet közvetlenül ezután a második mikroorganizmus 2-keto-L-gulonsawá alakít át. A találmány szerinti eljárás kivitelezése során a például a 3,998,697. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt, a „kevert tenyésztésiben és ezt követő lépésekben alkalmazott ismert szokásos körülmények hasonlóan alkalmazhatók néhány magától értetődő módosítással és kiigazítással. A „kevert tenyésztés” a következő három — (a), (b) és (c) - eljárást öleli fel: (a) eljárás, amelyben a kétfajta mikroorganizmust egyidejűleg oltjuk be a táptalajba a tenyésztés kezdetén; (b) eljárás, amelyben a táptalajt az első mikroorganizmussal oltjuk be, és a második mikroorganizmust egy bizonyos inkubálási szakasz után oltjuk be a tenyészetbe; es (c) eljárás, amelyben a két mikroorganizmust külön-külön oltják be a megfelelő táptalajokba, és utána egyiküket adják a másik fermentléhez egyszerre, apránként,vagy folyamatosan bizonyos inkubálási periódus után egy másik inkubálási periódussal követve. Azon célból, hogy a mikroorganizmusok a végterméket, a 2-keto-L-gulonsavat a leghatékonyabban termeljék, meg kell határozni a két mikroorganizmus inokulum méreteinek arányát és az inokulálás idejét a két mikroorganizmus növekedési sebességének, az első mikroorganizmus 2,5-diketo-D-glükonsav termelő aktivitásának, a második mikroorganizmus 2,5-diketo-D-glükonsavat 2-keto-L-gulonsavvá alakító aktivitásának és a táptalaj tulajdonságának figyelembevételével. Ezek a megfontolások azonban nem korlátozódhatnak csupán a jelen találmány példáiban leírtakra. A jelen találmány megvalósításában alkalmazható első és második mikroorganizmusokat [a továbbiakban (I) törzsnek és (11) törzsnek nevezzük] az 1. és 2. táblázatban soroljuk fel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
