191134. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hőálló alfa-amiláz enzim előállítására
3 191 134 4 c) lépés A fenti, rázott lombikos tenyészet teljes mennyiségét használjuk inokulumként a 3150 ml végső térfogatú, alábbi összetételű fermentációs táptalaj átoltásához: Vizes fermentációs közeg tömeg% Laktóz* 10 % Dikálium-hidrogén-foszfát* 1,4 % Kálium-dihidrogén-foszfát* 0,6 % Ammónium-szulfát 0,6 % Nátrium-citrát 0,3 % Teljes szójaliszt 3,0 % Kalcíum-klorid-dihidrát 0,05 % Mazu DF 6000 (habzásgátló) 1,0 ml Kezdeti pH = 6,8 - 7,0 * A többi összetevőtől elkülönítve autoklávozzuk. A fermentort 1 órán át 121 °C hőmérsékleten, 1,03 • 105 Pa túlnyomáson tartjuk. Az alfa-amiláz enzim optimális termelése érdekében a táptalaj pH-jának 8,0 alatt, de 5,5 fölött kell lennie. A mikroorganizmus szaporodása során esetlegesen fellépő habzás meggátlására egy szokásos berendezés segítségével Mazu DF 6000 jelzésű habzásgátlót adagolunk a táptalajba. Fermentációs körülmények : Fordulatszám : 600/perc Hőmérséklet: 40 °C A levegőztetés sebessége: percenként 1 liter/1 liter táptalaj. A táptalaj pH-ját 72 órás tenyésztés után megmérjük; a pH általában 6,5 és 7,0 között van. Az alfa-amiláz enzim aktivitását önmagában ismert módszerekkel mérjük. Egy ilyen módszer a Wohlgemuth-módszer egy módosított változata, amelynek során az enzim aktivitásának meghatározása céljából a keményítő dextrinizálódásának meghatározott mértékét jelző színváltozás létrejöttéhez szükséges lebontási időt mérjük. A módszert úgy állítjuk be, hogy az amiláz aktivitását az alábbiakban leírt módon, közvetlenül íikvefon/g egységekben lehessen kiszámítani. Az alfa-amiláz enzim likvefon/g egységekben kifejezett aktivitását a következőképpen határozzuk meg: A mintából 0,025 mólos kalcium-klorid-oldattai mint oldószerrel és mint hígítószerrel olyan oldatot készítünk, hogy a végső koncentrációra hígított minta 5 ml térfogatú részletének dextrinizálási ideje körülbelül 10 perc legyen. Ha az enzim-készítmény aktivitását hozzávetőlegesen sem ismerjük, akkor a megfelelő mintaméretet és/vagy hígítást próbálgatás útján határozzuk meg. 5,0 ml híg jód-oldatot 13 x 200 mm méretű kémcsövekbe töltünk, és a kémcsöveket 30 °C hőmérsékletű vízfürdőbe állítjuk. 10-12 ilyen kémcsövet használunk. 10 ml Lintner-féle keményítő-oldatot (szoluilizált keményítő, melyet általában enzimatikus, főként amiláz aktivitás analíziséhez használnak) egy 23 x 200 mm méretű kémcsőbe öntünk, és a kémcsövet egy 30 ”C hőmérsékletű vízfürdőbe állítjuk. 25 — 30 ml híg, ismeretlen aktivitású alfa-amilázoldatot 23 x 200 mm méretű kémcsövekbe töltünk, és a kémcsöveket 30 °C hőmérsékletű vízfürdőbe állítjuk. Az ismeretlen aktivitású, hígított enzimminta 5 ml térfogatú részletét 10 ml keményítőoldathoz öntjük, eközben a stopperórát akkor indítjuk el, amikor az ismeretlen aktivitású alfa-amiláz-oldat felét beadagoltuk, majd az oldat másik felét ezután adjuk a keményítő-oldathoz. Megfelelő időközönként a keményítőt és alfaamiláz-oldatot tartalmazó hidrolizáló elegy 1 ml térfogatú részleteit 1 ml-es pipettával belemérjük a megfelelő hőmérsékleten tartott híg jód-oldatba. Az elegyet minden alkalommal összerázzuk, beleöntjük egy 13 mm-es precíziós, négyzet keresztmetszetű küvettába, és egy Hellige-komparátorban összehasonlítjuk a standard alfa-amiláz színtárcsával. Az 1 ml-es pipetta tartalmát belefújjuk a jód-oldatba, hogy ezáltal pontosabban mérhessük a hidrolízis időtartamának végpontját. Amikor a hidrolízis végpontját már közel elértük, akkor 0,1 perc időközönként (6-12 másodpercenként) kell mintákat vennünk. Amikor a reakció teljesen végbemegy, feljegyezzük az időtartamot és a hígítást, és az enzim aktivitását likvefon/g vagy likvefon/ml egységekben számítjuk ki. Az enzim aktivitását az alábbi képlettel számítjuk ki: Likvefon/g /vagy /ml) = ___________1140____ Hígítás x a minta tényleges súlya (vagy térfogata) x dextrinizálási idő (perc) A fenti aktivitás-meghatározási módszerben használt oldatokat az alábbi módon állítjuk elő : Keményítő-oldat 10 g Lintner-féle keményítőt egy lombikban összekeverünk 35 ml desztillált vízzel, az elegyet felforraljuk, és 5 percig állandó keverés mellett forraljuk. Utána szobahőmérsékletre hűtjük, hozzáadunk 125 ml acetát-puffer-oldatot, majd annyi vizet, hogy ezzel az elegy térfogatát 500 ml-re egészítjük ki, és végül hozzáadunk 1 ml toluolt. Az oldat stailitását az alfaamiláz enzim ismert aktivitású, standard mintájának segítségével ellenőrizzük. A cetát-puffer-oldat Kimérünk 1 mól (82,0 g) nátrium-acetátot, és feloldjuk 800 ml vízben. Az oldat pH-ját ecetsavval 6,2 ±0,1-re állítjuk, majd az oldatot 1 liter térfogatra hígítjuk. 1 liter keményitő-szubsztrát előállításához a fenti puffer-oldat 20 ml térfogatú részletét használjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
